Indicaciones y preinscripciones par analizar y utilizar las muestras de laboratorio.

1. GRUPO
1
UNIVERSIDAD NACIONAL JOSÉ
FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN
FACULTAD DE INGENIERÍA AGRARIA, INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
Y AMBIENTAL
CARRERA PROFESIONAL INGENIERÍA AMBIENTAL
“PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU
OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO ÓPTICO”
INTEGRANTES
• Espinoza Reyes Naissa Jimena
• Garro Lazaro Marco Antonio
• Huata Rosales Ketty Roxana
• Julca Tarazona Mireya Zoraida
• Sanchez Cajaleon Jorge Alberto

2. RESUMEN
01
INTRODUCCIÓN
02
MATERIAL NESESARIO PARA LA
PREPARACION DE MUESTRA
Preparación de la
muestra
03
PREPARACIÓN DEL MATERIAL
MICROBIOLOGICO PARA LA
MICROSCOPIA
04
RECOMENDACIONES,
CONCLUSIONES Y
REFERENCIAS
 Preparación de muestra
 Preparacion preparado fijo
para tinciones
 Preparación en fresco
 Preparación en seco
05
ÍNDICE

3. El microscopio óptico se ha utilizado como una herramienta fundamental para proporcionar imágenes
magnificadas de objetos imperceptibles a simple vista.
Una imagen óptica es una representación discreta de distribución de intensidades en una superficie
hacia la cual se dirigen los rayos que derivan de un objeto iluminado tras interactuar con un sistema
óptico. El resultado de la interacción de la luz con la muestra y su entorno es impreso en la imagen,
ésta provee información sobre la estructura de la muestra como su morfología y distribución espacial.
El análisis y estudio de esta información abre la posibilidad de determinar algunas propiedades físico-
químicas de las muestras y su contribución en otros procesos del ambiente en el que están
relacionados. El microscopio óptico de campo claro se ha utilizado como herramienta de análisis en
aplicaciones biológicas como la clasificación de células, estudios de tráfico intracelular de moléculas,
el análisis histológico para detectar defectos en células humanas, etc. Una de las limitaciones de esta
técnica es la dificultad para formar imágenes de muestras muy delgadas, por tal razón se han
desarrollado otras técnicas de iluminación que compensan este tipo de limitaciones como la
microscopía de contraste de fase, la microscopía de campo obscuro, la microscopía de fluorescencia y
la microscopía confocal, entre otras.
1 RESUMEN

4. Los microorganismos son demasiado pequeños para ser detectados por
el ojo humano, por ello, es esencial la observación microscópica para
determinar la forma, el tamaño, agrupamiento y características de
coloración de los mismos. Generalmente, éstos son los primeros datos
que se obtienen cuando se desea saber qué tipo de bacteria u hongo es.
Con el microscopio óptico se consigue un amplio margen de aumento
que puede alcanzar desde 10 a 1000 diámetros
Para ello es necesario saber si observaremos una muestra viva o
muerta, si queremos ver la muestra entera o simplemente una sección y
si será necesario utilizar tintes para poner de relieve una característica
concreta.
También es importante conocer la duración de la observación ya que
esto determina si será necesario hidratar la muestra para evitar que se
seque.
INTRODUCCIÓN

5. MATERIAL NESESARIO PARA LA
PREPARACION DE MUESTRA
Historia del microscopio:
Los microscopios de Anton van Leeuwenhoek constaban
de una única lente pequeña y convexa, montada sobre
una plancha, con un mecanismo para sujetar el material
que se iba a examinar (la muestra o espécimen).
Leeuwenhoek realizó las primeras observaciones de
microorganismos en el agua de lluvia, sarro de dientes,
sangre, semen, excrementos, etc., describiendo unos
pequeños animales de gran diversidad. Un microscopio
óptico es un microscopio basado en lentes ópticas.
También se le conoce como microscopio de luz (que
utiliza luz o «fotones») o microscopio de campo claro.

6. Preparación de la muestra:
Portaobjetos
NH3
H
H
N
N
O
El primer paso antes de empezar a preparar
una muestra es asegurarnos que disponemos
de todo el material que necesitaremos.
El portaobjetos es una pequeña pieza de vidrio con unas
dimensiones de aproximadamente 76 x 26 mm y entre 1 y 1.5
milímetros de espesor. Su función es servir de soporte para la
muestra ya que es sobre él que colocaremos el espécimen
que queremos observar.
Es importante manipular con cuidado el portaobjetos ya que
sus cantos afilados pueden en ocasiones producir cortes.
Para evitar lesiones existen portaobjetos con las esquinas
esmeriladas.

7. Cubreobjetos
El cubreobjetos es también una pequeña pieza de vidrio con unas dimensiones menores que el
portaobjetos. El cubreobjetos tiene una forma cuadrada con un lado de entre 18 y 20 milímetros y un
espesor de entre 0.13 y 0.17 mm.
Debido a su espesor extremadamente bajo, el cubreobjetos es un elemento extremadamente frágil y, por lo
tanto, hay que manipularlo con cuidado.
Durante la preparación de la muestra es habitual añadir unas gotas de agua sobre la muestra.
Función:
 Mantener la muestra en su sitio y protegerla de posibles contaminaciones.
 Es una medida de protección para evitar que la lente del objetivo entre en contacto con la muestra.
 La colocación del cubreobjetos sobre estas gotas de agua permite aplanar el líquido y facilita el
enfoque sobre el plano de la muestra.

8. Pinzas
Instrumento para agarrar cosas, en especial cosas
pequeñas, que consiste en dos piezas unidas por un
extremo y separadas por el otro, que se juntan o se
separan haciendo presión con los dedos por el centro o
por uno de sus extremos
Pipeta
La pipeta es un instrumento de laboratorio que permite
medir y dosificar un líquido con gran precisión. En el
campo de la microscopía se utiliza para colocar sobre
la muestra la cantidad de líquido adecuada para su
hidratación o simplemente para colocar sobre el
portaobjetos una cantidad limitada de líquido que
contiene la muestra

9. Tinta y papel absorbente
La tinción es uno de los recursos utilizados para poner de relieve
algunas características concretas de la muestra observada. Existe
una gran cantidad de técnicas de tinción y su uso en cada caso
depende de la muestra observada.
En los procesos de tinción se utilizan colorantes y tinturas que se
mezclan con la muestra para mostrar estructuras que de otro
modo permanecerían invisibles. Una distinción importante es
entre la tinción in vivo, que incluye las técnicas para teñir células
vivas, y la tinción in vitro, que se refiere a las técnicas para teñir
células muertas.
Cuando se utilizan tintes es habitual utilizar también papel
absorbente para deshacerse de un posible exceso de tinte sobre el
portaobjetos.

10. PREPARACIÓN DEL MATERIAL MICROBIOLÓGICO PARA
MICROSCOPÍA
La observación microscópica constituye la primera etapa del estudio de los
microorganismos y también el diagnóstico microbiológico ya que permite
conocer algunas características de los microorganismos, como: forma,
disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras (cápsulas,
esporas, flagelos), movilidad, etc. El estudio "en fresco" se desarrolló cuando
todavía no se habían inventado la fijación y la tinción. Actualmente se siguen
utilizando, sobre todo gracias al desarrollo de las técnicas de contraste de
fases y contraste interferencial.

11. Un estudio “en fresco" es aquel que no precisa un tratamiento en el que se maten
las células, como es la fijación o la inclusión. Las bacterias no teñidas muestran
pocos detalles morfológicos, el diagnóstico bacteriológico generalmente se basa
en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias para identificarlos más
adecuadamente. Sin embargo, también resultan útiles las preparaciones no
teñidas en la determinación de la movilidad. Las preparaciones fijas y teñidas son
de uso casi universal, tanto a partir de especímenes recibidos como de colonias
cultivadas. En general una muestra del espécimen original puede ser colocada
directamente sobre el portaobjetos o bien ser recogida con un asa, recordando
siempre tener una preparación delgada y homogénea. Una colonia puede ser
examinada haciendo con ella una suspensión tenue en una gota de solución
salina, y luego extendiéndola con un asa sobre un portaobjetos. Las películas
secadas al aire son fijadas con calor suave sobre la flama de un mechero y luego
pasadas a través de ella. Debe tenerse cuidado para evitar el calor excesivo, que
puede alterar la forma bacteriana. El calor deseable es aquel en el que el
portaobjetos sea apenas caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

12. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA:
Para observar una muestra al microscopio óptico
podemos recurrirá a:

13. Preparación húmeda
Se realiza colocando una gota de la suspensión de
microorganismos entre un porta y un cubreobjetos. Se
observa directamente.
Preparación fijada: Se coloca una suspensión homogénea
de microorganismos en una gota de agua sobre el
portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos) y
después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas
preparaciones se observan sin cubreobjetos y, habitualmente,
con objetivos de inmersión.

14. Preparación preparado fijo
para tinciones.
Secado
Fijado
1
2
La extensión del material sobre el portaobjetos se hará de
diferentes formas, en función de la procedencia del
producto a examinar. Si el producto es líquido, se
depositará una pequeña cantidad de material en el centro
del porta, extendiéndolo con el asa hasta conseguir una
capa fina y homogénea. Si la extensión debe hacerse a
partir de un cultivo en medio sólido, la colonia que
vayamos a estudiar se mezclará con una gotita de agua
destilada estéril colocada en el centro del portaobjeto.
Una vez realizado el frotis, debemos
dejar secar al aire la preparación, cuando
está seca la superficie pasa de ser
brillante a mate; para acelerar el secado
se puede calentar ligeramente la parte
inferior del portaobjetos (sin quemar).
La fijación es el último paso antes de proceder a la
tinción, y tiene como objetivo no permitir que la
muestra de estudio se pierda (o se barra) en el proceso
de tinción.
En frotis hematológicos no se requiere de fijación
debido a que existe una coagulación rápida de las
albúminas citoplasmáticas; o si el material a teñir
posee abundante material celular, se recomienda fijar
con alcohol metílico después de secar la preparación.

15. Preparado en fresco
Las preparaciones en fresco mantienen la hidratación
durante un periodo de aproximadamente 30 minutos. Si
se requiere mantener la muestra hidratada durante un
espacio de tiempo más largo pueden sellarse los
bordes del cubreobjetos con vaselina. En este caso se
evita la evaporación del líquido durante unas horas o
incluso unos días.
La preparación en fresco es ideal para la observación de
microorganismos o de tejidos biológicos que requieren ser
hidratados

16. A
B
C
D
E
Si la muestra es líquida colocamos unas gotas de la muestra en el centro del portaobjetos
con la ayuda de una pipeta.
Si la muestra es sólida colocamos primero unas gotas de agua destilada o de solución salina sobre el
portaobjetos y a continuación un fragmento de la muestra con la ayuda de unas pinzas.
Sujetando el cubreobjetos por dos de sus lados, apoyamos otro de sus lados sobre el portaobjetos de modo
que forme un ángulo de aproximadamente 45 grados.
A continuación, podemos soltar con cuidado el cubreobjetos de modo que quede colocado sobre el líquido
que hemos depositado anteriormente. (Mediante este procedimiento se evita la formación de burbujas dentro
de la muestra. En caso de que hayan aparecido burbujas entre el portaobjetos y el cubreobjetos será necesario
repetir el procedimiento anterior.)
En caso de que haya un exceso de líquido alrededor del cubreobjetos podemos eliminarlo
mediante papel absorbente.

17. Preparado en Seco
La preparación en seco es ideal para muestras que no
necesitan hidratación. Esto incluye, por ejemplo, un cabello,
granos de polen, esporas, muestras de plantas, insectos, etc.
A Si la muestra es totalmente opaca el primer paso consistirá en cortar
primero una sección muy fina de la muestra. Esto permitirá observarla
en el microscopio mediante luz transmitida.
B Colocamos la sección que hemos cortado en el centro del portaobjetos
con la ayuda de unas pinzas. Si la muestra tiene un cierto volumen es
recomendable utilizar un portaobjetos con una cavidad cóncava
C Para mantener la muestra fija en su sitio la cubrimos con un
cubreobjetos. Esto evita también que el objetivo llegue a tocar la
muestra en caso de cometer algún error durante la manipulación del
microscopio

18. Conclusión
 El microscopio es sin duda una herramienta muy importante para los seres
humanos, una herramienta muy factible ya que ayuda a la medicina y su evolución
lo hace aún más satisfactorio para la investigación.
 La preparación de la muestra es esencial para evaluar los resultados, es por ello que
la muestra debe ser una cantidad limitada que un organismo, se debe preparar para
la observación que consiste en someter a la tinción colorear los microorganismos
con un colorante que destaque ciertas estructuras de esto para llevarse a cabo se
siguen dos procesos el proceso de extensión y el de fijación la extensión se da a
partir de una muestra la cual se extiende una película delgada del material que
contiene los microorganismos sobre la superficie de un portaobjetos.

19.  A través de la llama de un mechero bunsen con el extendido hacia arriba la fijación
produce la muerte simultánea de los microorganismos y su adherencia al portaobjetos si
no se realiza el colorante puede arrastrar los microorganismos del portaobjetos y
cuando vamos a realizar la observación a través del microscopio. Realizar la tinción
empezamos con la muestra la cual se va a ser un proceso de extensión como con
movimientos circulares y luego el proceso de fijación a través de la llama de un
mechero bunsen que finalmente se puede proceder a seguir con atención para realizar la
tinción.

20. Recomendaciones
Como sabemos el microscopio es un instrumento de precisión construido de valiosos y delicados
materiales, con un buen mantenimiento y cuidado tal instrumento durara muchos años.
 Si vamos a mover constantemente nuestro equipo es conveniente tomarlo de las partes que nos
indica el proveedor generalmente es del brazo o cuello del microscopio, estando frío por supuesto
esto evitará que se fundan los focos de iluminación, el lugar de almacén del deberá ser lo más limpio
del polvo, humedad, o exceso de calor en anaqueles estables y fijos.
 Al iniciar el mantenimiento de un microscopio es muy importante tener las herramientas y los
materiales adecuados, como soluciones líquidas preparadas para la limpieza; y por supuesto un área
destinada para el mantenimiento.
 Cuando se inicia un buen mantenimiento NO es necesario desensamblar todas sus partes: ópticas,
mecánicas y electrónicas, porque todos ellos están provistos de sellos del fabricante y con la garantía
de seguridad de que no se penetrará nada nunca en condiciones normales de trabajo, además se corre
el riesgo de confundir una cara de cualquier lente interna ya sea del ocular o del objetivo.

21.  Artedinámico. HISTORIA DEL MICROSCOPIO. [citado el 12 de julio de 2022]; Disponible en:
https://www.equiposylaboratorio.com/portal/articulo-ampliado/historia-del-microscopio
 C. Bayles, Light and Video Microscopy (American Institute of Biological Sciences, 2010).
 J. Carlos, “Descubriendo el microscopio”, Centro de investigaciones en óptica. S.A. (2014)
 J. Pawley, Handbook of biological confocal microscopy (Springer, 2010).
 K. K. Ghosh, L. D. Burns, E. D. Cocker, A. Nimmerjahn, Y. Ziv, A. E. Gamal, and M. J. Schnitzer,
"Miniaturized integration of a fluorescence microscope," Nat. Methods 8, 871-878 (2011).
 Mundo microscópico, “Preparación de muestras para microscopio óptico”
(https://www.mundomicroscopio.com/preparacion-de-muestras/)
 N. S. Claxton, T. J. Fellers, and M. W. Davidson, "Microscopy, Confocal," in Encyclopedia of Medical Devices
and Instrumentation (John Wiley & Sons, 2006).
 Real Academia Española. (2014). Diccionario de la lengua española. Recuperado de: https://dle.rae.es/pinza
 Universidad Nacional de Piura, “Microbiología general”, (2017)
(http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/microgeneral/wp-content/uploads/2017/02/02-MICROSCOPIA.pdf)
Bibliografia