tinciones

1. TECNICAS DE
TINCIONES
BACTERIANAS Y
COLORANTES

2. OBJETIVOS
• Aprender a preparar frotis bacterianos
• Realizar tinciones simples y diferenciadas, empleando diversos tipos de colorantes.
• Estudiar la morfología bacteriana y las coloraciones que adoptan en condiciones naturalesy
aprender a distinguir los diversos tipos de agrupaciones bacterianas , dependiendo del tipo de
tinciones al observar al microscopio.
• Diferenciar entre colorantes ácidos y básicos
• Poder diferenciar entre bacterias grampositivas y gramnegativas , bacterias ácidos-alcohol
resistentes, endoesporas, cápsulas bacterianas en una población mixta de bacterias.

3. INTRODUCCION
• Como casi todos los microorganismos, son casi incoloros
cuando se observan a través del microscopio óptico
estándar, a menudo es preciso prepararlos para la
observación y una de las maneras de hacerlo consiste en
someterlos tinciones (coloración)

4. TÈCNICAS DE
OBSERVACIÒN
MICROSCOPICAS

5. TIPO DE OBSERVACIONES
MICROSCÓPICAS
1. OBSERVACIÒN EN FRESCO
2.OBSERVACION CON TINCIONES

6. 1. Observación en fresco
Son preferibles en las situaciones siguientes:
• La morfología de las bacterias se altera cuando se desecan y tiñen.
• Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad
• Para observar los cambios citológicos que ocurren durante la división celular
• Por este método se observan fácilmente algunas inclusiones celulares como vacuolas y materias grasa.
2. Observación con tinciones
• Para observar las características morfológicas de las bacterias
• Identificación y diferenciación de microbios entre especie y dentro de la misma especie (tinción
diferencial o selectiva).
Lunes
TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

7. 1. Observación en fresco
•preparación en fresco simple
•preparación en gota pendiente
2. Observación con tinciones
a) Tinción simple: un solo colorante.
b) Tinción diferencial: más de un colorante
c) Tinción especial: Para teñir capsulas, flagelos y esporas
Tinción negativa: colorea el medio que rodea a la bacteria
permaneciendo ésta sin teñir.
Lunes
TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

8. TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS
1. Observación en fresco
Son preferibles en las situaciones siguientes:
• La morfología de las bacterias se altera cuando se desecan y tiñen.
• Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad
• Para observar los cambios citológicos que ocurren durante la división celular
• Por este método se observan fácilmente algunas inclusiones celulares como vacuolas
y materias grasa.

9. 2. Observación con tinciones
• Para observar las características morfológicas de las bacterias
• Identificación y diferenciación de microbios entre especie y
dentro de la misma especie (tinción diferencial o selectiva).
•
TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

10. EXAMEN EN FRESCO
• El examen en fresco de una suspensión microbiana , es la técnica de observación microscópica
más fácil y rápida de realizar.
• Es el método de elección cuando se desea evitar la alteración que sufren los microorganismos
de una muestra cuando es sometida a una fijación y tinción.
• Posibilita la observación de microorganismos vivos.
• Permite estudiar la morfología y estructura celular , tamaño reales, color natural y movimiento.
• La contraparte , es que si los microorganismos carecen de color natural, dando resultados
deficientes , debido a su reducido contraste.

11. • Consiste en observar los microorganismos vivos que puede haber en la muestra de
estudio y la presencia de otros elementos, como son leucocitos, células, eritrocitos,
cristales, etcétera, que puedan ser de gran ayuda en la valoración de las muestras.
Y se prepara de la siguiente manera:
• Es una técnica fácil de realizar, en la que la muestra a examinar se sitúa entre un
portaobjetos y cubreobjetos. Si la muestra proviene de una muestra sólida, se debe de
emulsificar en una gota de agua destilada o solución salina; si el material es líquido, se
deposita directamente entre el porta y cubreobjetos.
EXAMEN EN FRESCO

12. OBSERVACIÓN EN FRESCO
Las observaciones en fresco, se las puede realizar de dos maneras:
•Preparación en fresco simple ò Cámara húmeda
(lamina/laminilla)
•Preparación en gota pendiente

13. PREPARACIÓN EN FRESCO SIMPLE Ò CÀMARA HÙMEDA
(LAMINA/LAMINILLA)
• Materiales:
• Porta y cubre
• Gotero(pipeta)
• Muestras de agua estancadas.
• Microscopio
• Procedimiento:
• Se prepara el microscopio para el uso
respectivo.
• Con el gotero se saca la muestra.
• Se le coloca en el porta objetos, una gota.
• Luego se le coloca el cubre.
• Y se procede a la observación.
• Solo debe realizarse la observación en
objetivos de 40 x , luego a 4x, 10x,
Se realizan a través de suspensiones de células o microorganismos
NOTA: No debe emplearse el objetivo de
inmersión , pues al desplazar la preparación el
cubreobjeto permanece adherido al objetivo y esto
crea turbulencias en el liquido de preparación

14. Porta objeto
Muestra
1. Colocar una gota de SSF o agua en un
porta
2.- Tomar la muestra con el asa de siembra
o un gotero
PROCEDIMIENTO PARA UN PREPARADO EN FRESCO
("entre porta y cubre")

15. PREPARACIÓN EN FRESCO GOTA
PENDIENTE
• Con el estudio de la gota pendiente, se puede conocer la motilidad de los
microorganismos,
• Sus agrupaciones naturales, sus reacciones en presencia de ciertas sustancias
químicas.
• Son aquellas que se realizan por la acción de la tención superficial que tiene
suspensiones de los microorganismos
• El volumen del liquido que mantiene el portaobjeto es mayor de manera que
la preparacion tiene un mayor tiempo de vida

16. REALIZACION DE LA OBSERVACION MICROSCOPICA,
PREPARACIÓN EN FRESCO GOTA PENDIENTE
MATERIALES:
• LAMINAS ESCAVADAS
• AGUA ESTANCADA
• MICROSCOPIO
• PIPETA (O GOTERO)
• PORTA Y CUBRE OBJETOS
PROCEDIMIENTO:
• AL NO ENCONTRAR LAMINAS ESCAVADAS, REALIZAMOS UNA
ARTESANALMENTE, USANDO CERA DE VELA Y CON AYUDA DE UN
SACABOCADOS.
• AL NO ENCONTRAR UNA LAMINA EXCAVADA, REALIZAMOS LA MISMA
OPERACIÓN QUE EN LA ANTERIOR MUESTRA:
• SE COLOCA UNA GOTA EN EL CUBRE OBJETOS QUE PREVIAMENTE A SIDO
UNTADA UN POCO CON VASELINA CRUDA O CERA.
• SE LE COLOCA EN FORMA INVERTIDA EN EL PORTA OBJETOS QUE
ARTESANALMENTE FABRICAMOS.
• PROCEDEMOS AL OBSERVACIÓN

18. PREPARACIÓN DEL FROTIS:
• De la muestra sobre el portaobjetos se hará de diferentes formas, dependiendo de la
procedencia de la muestra a examinar.
• Si es líquida, se deposita una pequeña cantidad del material en el centro del portaobjetos y
se extiende con otro portaobjetos hasta conseguir una capa fina y homogénea.
• Si el material de estudio es sólido, se emulsificará en una gota de agua destilada o solución
salina estéril, colocado en el centro del portaobjetos, y se extiende de la misma forma que
una muestra líquida. Extender directamente sobre el portaobjeto la muestra recogida con
torunda, procurando que quede una capa fina y homogénea, con un movimiento de
rotación a la torunda , conforme se vaya deslizando sobre el portaobjeto.
a) EXTENSIÓN

19. a) Frotis o película (extensión)
• Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados
PREPARACIÓN DEL FROTIS:

21. b) SECADO
Una vez realizado el frotis, debemos dejar secar al aire la preparación, cuando está seca la superficie pasa de
ser brillante a mate; para acelerar el secado se puede calentar ligeramente la parte inferior del portaobjetos
(sin quemar).
c) FIJADO
La fijación es el último paso antes de proceder a la tinción, y tiene como objetivo no permitir que la
muestra de estudio se pierda (o se barra) en el proceso de tinción.
En frotis hematológicos no se requiere de fijación debido a que existe una coagulación rápida de las
albúminas citoplasmáticas; o si el material a teñir posee abundante material celular, se recomienda fijar con
alcohol metílico después de secar la preparación.
Los frotis de origen microbiológicos se deben de fijar con calor suave, pasando el portaobjetos sobre una
llama, tras la fijación es muy importante esperar que se enfríe antes de proceder a realizar cualquier
procedimiento de tinción.
PREPARACIÓN DEL FROTIS:

22. PREPARACIÓN DEL FROTIS:
• El propósito de la Fijación es matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la célula y
adherir la preparación al portaobjetos. Sin el proceso previo de fijación se lavaría la capa de células
durante el proceso de tinción.
• El agente fijador ideal preserva las estructuras de la célula con su forma y posición sin que aparezcan
estructuras que no existían en la célula original.
• El calor , es en general el método de fijación mas utilizado para la observación de la morfología de
células bacterianas.
• El método químico, Cuando además de los microorganismos interesa la observación de
células animales, se utiliza un método químico como la fijación por metanol y por formol, que altera
menos que el calor la morfología de las células.

23. Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas)
TIPOS
• CON CALOR (O MÉTODO DE KOCH)
• FIJACIÓN QUÍMICA: alcohol metílico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y
éter)
Metanol
c) FIJACIÓN DEL FROTIS

24. MATERIALES
• Portaobjetos limpios,
secos y sin grasa
• Capilares para la sangre
• Muestra
TECNICA
• Por calor: Pasamos tres veces el portaobjetos por la llama
durante unos segundos. Dejamos enfriar el porta entre los pases.
• Con metanol (para bacterias procedentes de medio líquido):
Añadimos unas gotas de metanol sobre la extensión
completamente seca. Golpeamos el portaobjetos por su canto
con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato
el exceso de metanol. Esperamos a que el metanol se evapore
completamente.
• Una vez realizado el Frotis y fijadas las bacterias, podemos
observar las preparaciones al microscopio, aunque carecen de
contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tinción.
PREPARACIÓN DEL FROTIS:

25. FROTIS
PROVENIENTES
DE CULTIVOS
(SOLIDO Y
LIQUIDO)

26. COLORANTES
BACTERIANOS

27. COLORANTES
Hacen más visibles las estructuras internas y
externas aumentando el contraste con el fondo
2 características fundamentales :
1. Grupos cromóforos:
• Con dobles enlaces conjugados
• Dan al colorante su color.
2. Afinidad por los componentes celulares
Por enlaces iónicos (más comunes) , covalentes o
hidrófobos

28. a) SALES COLORANTES: más comúnmente usados
1. BÁSICOS:
 Consisten en un catión coloreado unido a un anión incoloro. Tiñen la célula bacteriana
uniformemente , Afinidad por las estructuras ácidas: (ácidos nucleicos y los polisacáridos
ácidos ) (cromatina nuclear de pro y eucariotas) (más usados en citología bacteriana).
Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta
2. ÁCIDOS:
Tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado. No tiñen la célula bacteriana, pueden
usarse como color de contraste (coloración negativa). Tiñen estructuras citoplasmáticas de las
células eucariotas, Afinidad por las estructuras alcalina (hemoglobina)
Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina ácida y el rojo Congo.
COLORANTES: Tipos

29. 3. Neutros:
• Sales de un ácido y de una base coloreados.
• Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.
• Eosinato de azul de metileno.
b) COLORANTES LIPOSOLUBLES
• Se combinan con los componentes lipídicos de la célula, usados para revelar la
localización de los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán.
4. Indiferentes:
• Insolubles en el agua y tiñen a aquellas sustancias que tienen un poder de disolución
superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante.
• Sudán III  para teñir las grasas.
COLORANTES: Clases

30. • Vitales
• Son aquellas que se practican sobre células que están vivas, mediante la
introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo.
• Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
• Supravitales
• Son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados
del organismo del que proceden.
• No vitales
• Se realizan sobre células muertas.
COLORACIONES : Tipos

31. TINCIONES
BACTERIANAS

32. QUE ES UNA TINCIÒN?
• Una tinción es un procedimiento para visualizar un tejido
que puede implicar el uso de uno o varios colorantes de
modo simultáneo o sucesivo

33. FINALIDAD DE LAS TINCIONES
BACTERIANAS
• Aumenta la resolución
• Acentúa las características morfológicas
• Conserva la muestra

34. FIJACION
• Las células teñidas que se observan con un microscopio deben parecerse lo más posible a
las células vivas.
• La Fijación es el proceso por el cual se conservan y fijan su posición las estructuras
externas e internas de las células de los microorganismos.
• Inactiva enzimas, que pueden alterar la morfología celular.
• La fijación, endurece la estructura celular, de manera que no cambien durante la fijación ,
ni en la observación.
• Durante la fijacion , se mata al microorganismo. fijándose al portaobjetos.

35. FIJACION DE LA MUESTRA BACTERINA
• Preserva la morfología general pero
no las estructuras internas
QUIMICA
• Protege la subestructura fina y la
morfología de los microorganismos
delicados de mayor tamaño

36. FIJACION QUÌMICA
• Aldehídicos
• Ácido ósmico
• Tetróxido de osmio.
• Compuestos mercúricos y
crómicos
• Alcoholes, la acetona,
• el dietil-pirocarbonato.

37. 1) Tinciones simples
2) Tinciones diferenciales
• Tinción de Gram
• Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen)
3) Tinciones especificas
• Tinción de esporas de Wirtz-Cortitlin
• Tinción de flagelos de Leifson
• Tinción negativa, / Tinciòn de càpsulas (HISS)

38. TIPOS DE TINCIONES
TINCIÓN SIMPLE
Un solo colorante.
• Colorantes básicos
Mas usados
Tienen cargas positivas
Ej.: Cristal violeta, fucsina básica,
safranina, verde malaquita
• Colorantes ácidos
Menos usados
Tienen cargas negativas
Ej.: Eosina, Fucsina ácida
TINCION DIFERENCIADA
• Se utilizan para distinguir entre tipos de
microorganismos
• Etapas :
• 1. Tinción primaria
• 2. Tinción de contraste o secundaria
• Ejemplo.:
• Coloración Gram,
• Coloración de Ziehl- neelsen,
• Esporas

39. ¿QUÉ ES TINCIÓN SIMPLE?
• Es la tinción que usa un
solo colorante
• Teñir el microorganismo
entero
• Reconocer estructuras y
morfología
• Azul de metileno, safranina,
fucsina fenicada

40. TINCIÓN SIMPLE

41. • Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos
• Etapas :
1. Tinción primaria
2. Tinción de contraste o secundaria
Ejemplo.:
- COLORACIÓN GRAM,
- COLORACIÓN DE ZIEHL- NEELSEN,
- ESPORAS
TINCIÓN DIFERENCIAL O COMPUESTA

42. TINCION DE GRAM
BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Y GRAM NEGATIVAS

43. TINCIONES DE GRAM

44. 30/06/2017 44
TINCION DE GRAM
.
• Ideada en 1884 por Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), un médico danés
con estudios en bacteriología y farmacología
• La coloración de Gram. tiene interés taxonómico ya que divide las bacterias en dos
grandes grupos:
• Bacterias Gram positivas que se tiñen de morado y
• Bacterias Gram negativas que se tiñen de rojo
• La coloración de Gram es positiva compuesta y diferencial.

45. 30/06/2017 45
TINCION DE GRAM
• La técnica revela diferencias constitutivas de la pared celular entre bacterias Gram
positivas y Gram negativas.
• La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglicano (*) , la cuál impide que escape el complejo cristal violeta-lugol.
• Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada y se
encuentra unida a una membrana externa lipídica, susceptible a la decoloración con el
alcohol-acetona, el que actúa como un solvente orgánico.
• Los lípidos se disgregan con el alcohol acetona y el decolorante penetra a la célula
bacteriana decolorándola.
* El peptidoglicano (PG) es una macromolécula única, con enlaces altamente entrecruzados, forma una bolsa que rodea a la membrana
celular bacteriana y que concede rigidez a la envoltura.

46. 30/06/2017 46
PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS
• El peptidoglicano se dispone en varias
capas lo que le otorga grosor a la pared.
• Atraviesan el peptidoglicano
polisacáridos ácidos, denominados
ácidos teicoicos.
• Los ácidos teicoicos son de dos clases:
poliglicerol fosfato y poliribitol fosfato.
• Las funciones primarias de estos
polímeros son la estabilización del
peptidoglicano y la captura de Mg++.
Los ácidos teicoicos son polímeros de glicerol o ribitol unidos mediante enlaces fosfodiéster. Estos ácidos se encuentran en la pared
celular de las bacterias Gram-positivas, tales como Staphylococcus, extendiéndose sobre la superficie de la capa de peptidoglicano..

47. 30/06/2017 47
PARED CELULAR EN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
• Su pared celular es más delgada, pero más compleja que la de los Gram positivas.
• El peptidoglicano se dispone en una sola capa, pero por fuera de ella se encuentra una segunda
membrana denominada membrana externa.
• La membrana externa es una membrana asimétrica, porque si bien la monocapa interna está formada
por fosfolípidos, la monocapa exterior está formada por un tipo especial de lípido, denominado
lipopolisacárido (LPS).
• El LPS es una molécula que contiene tres regiones diferentes: el lípido A, el core y el antígeno O.
• El LPS constituye una endotoxina, que se libera cuando la bacteria se divide o muere.
• Es un potente estimulador de los macrófagos, lo que causa la activa liberación de citoquinas,
responsables de las manifestaciones clínicas de las infecciones por bacterias Gram negativas y que varían
desde una fiebre hasta el shock séptico.
• En esta membrana externa se encuentran las porinas.
• La membrana externa de las bacterias Gram negativas poseen porinas que son canales cargados de agua
y que permiten la entrada y salida de sustancias de la célula al exterior y del interior de la célula.

48. 30/06/2017 48
• Entre la membrana externa y la membrana
celular se crea un compartimiento virtual,
llamado espacio periplásmico. Tiene una
gran importancia en el metabolismo
energético, que se basa en la alimentación
por procesos activos de diferencias de
composición química, concentración
osmótica y carga eléctrica entre este
compartimento y el citoplasma.
• El espacio periplásmico es una matriz que
incluye al peptidoglicano, enzimas, proteínas
captadoras de nutrientes y sustancias de
secreción.
• La membrana externa contiene numerosas
proteínas, siendo las porinas las más
abundantes.
• Se denominan así, porque forman poros que
comunican el exterior con el espacio
periplásmico.
PARED CELULAR EN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

49. 30/06/2017 49
TINCIÓN DE GRAM
• Protocolo
• Hacer un frotis
• Dejar secar al aire
• Fijar la muestra con calor a la llama de una lámpara de alcohol o
con el licor de Hoffman.

50. 30/06/2017 50
TINCIÓN DE GRAM
• Cristal violeta
• El lugol entra en las células y forma un complejo insoluble con el cristal violeta.
• La mezcla de alcohol-acetona sirve para realizar la decoloración. Las bacterias
Gram. positivas no se decoloran, mientras que los Gram. negativas sí lo hacen.
• Para poner de manifiesto las bacterias Gram. negativas se utiliza una coloración de
contraste de color rojo; safranina.
• Después de la coloración de contraste las células Gram. negativas se observan de
color rojo, mientras que las Gram. positivas se observan de color Morado.

51. 30/06/2017 51
INTERPRETACIÓN
Gram negativas Gram positivas

52. 30/06/2017 52
TINCIÓN BACTERIOLÓGICA DE GRAM.
El equipo para realizar la tinción de
Gram. consta de:
Colorantes y reactivos :
• Cristal Violeta, Yodo-Lugol y Safranina.
Solvente: Alcohol-Cetona.
Bandeja de tinción.
Asa bacteriológica o hisopo.
Frasco lavador.
Muestra bacteriana sólida (agar),
líquida (caldo) o espécimen clínico.

53. 30/06/2017 53
TINCIÓN DE GRAM
• Paso 1.- Cubrir la
preparación con Cristal
Violeta por 60 seg. y lavar
suavemente con agua.

54. 30/06/2017 54
TINCIÓN DE GRAM
• Paso 2.- Cubrir la
preparación con Yodo-
Lugol por 60 seg y lavar
suavemente con agua.

55. 30/06/2017 55
TINCIÓN DE GRAM
• Paso 3.- Cubrir la
preparación con Alcohol-
Cetona durante algunos
segundos (5-10) y lavar
suavemente con agua.

56. 30/06/2017Altagracia Jimenez Diaz MA 56
TINCIÓN DE GRAM
Paso 4.- Cubrir la preparación
con Safranina por 60 seg y lavar
suavemente con agua.
• Secar y Observar con lente de
100x (inmersión).

57. 30/06/2017 57
TINCIÓN DE GRAM
PREPARÁNDONOS PARA LA OBSERVACIÓN AL
MICROSCOPIO

58. ESTRUCTURA
Bacterias que se tiñen de azul oscuro o
violeta por la tinción de Gram

59. Bacteria Gram + Bacteria Gram -
Pared celular simple Pared celular compleja
Capa de peptidoglucano gruesa Capa de peptidoglucano fina
No capa externa de
lipopolisacáridos
Capa externa de lipopolisacáridos
Retienen cristal violeta/iodo-color
azul/violeta
Retienen safranina-color
rojo/rosado
DIFERENCIAS ENTRE GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS

60. GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS
POSEEN UNA PARED CELULAR INTERNA Y UNA PARED DE
PEPTIDOGLUCANO.
POSEEN UNA PARED CELULAR MÁS COMPLEJA:
-PARED CELULAR INTERNA
-PARED DE PEPTIDOGLUCANO
- BICAPA LIPÍDICA EXTERNA
NO TIENE MEMBRANA EXTERNA MEMBRANA EXTERNA
NO TIENE ESPACIO PERIPLASMÁTICO ESPACIO PERIPLASMÁTICO:
LA RED DE MUREÍNA ESTÁ MUY DESARROLLADA Y LLEGA A
TENER HASTA 40 CAPAS
LA RED DE MUREÍNA PRESENTA UNA SOLA CAPA
LA PENICILINA MATA A LAS GRAM POSITIVAS, LA PENICILINA NO MATA A LAS GRAM NEGATIVAS,
NO CONTIENE LPS CONTIENE LPS
EN LA TINCIÓN DE GRAM, RETIENEN LA TINCIÓN AZUL QUEDAN DECOLORADAS.
CONSERVAN EL COMPLEJO YODOCOLORANTE. PIERDEN EL COMPLEJO YODOCOLORANTE.
SON ESPORULANTES Y NO ESPORULANTES, COMO
STREPTOCOCCUS, CISTERIA, FRANKIA.
PUEDEN SER ANAEROBIOS O AEROBIOS
POSEEN OTROS COMPONENTES: ÁCIDOS TEICOICOS Y
LIPOTEICOICOS, Y POLISACÁRIDOS COMPLEJOS.
POSEEN PROTEÍNAS CON CONCENTRACIONES
ELEVADAS.

61. • Tipo de tinción diferencial empleado
para la visualización de bacterias.
• Basado en la composición de su
PARED CELULAR.
• Sirve para determinar la morfología
celular bacteriana y también para
realizar una primera aproximación a
la diferenciación bacteriana,
considerándose Bacteria Gram
positiva a las bacterias que se
visualizan de color violeta y
Bacteria Gram negativa a las de
color rosa.
TINCIÓN DE GRAM

62. Cocos Gram PositivosCocos Gram Negativos
Bacilos Gram Positivos Bacilos Gram Negativos
TINCIÓNDEGRAM
62

63. TINCIONES
ESPECIFICAS
Tinciones de esporas, flagelos y capsulas

64. • Mientras las tinciones diferenciales permiten distinguir entre
distintos tipos de microorganismos, las tinciones específicas
incrementan el contraste en las células microbianas y revelan
estructuras particulares, entre las que se incluyen las endosporas,
los flagelos y las cápsulas.

65. La tinción de esporas de Wirtz-Conklin
Tiñe selectivamente las endosporas.
• Tinción con verde de malaquita.
• Calentamiento a emisión de vapores durante 60 segundos, para que el colorante
penetre a través de las paredes de la endospora.
• Se lava con agua durante 30 segundos que elimina el colorante verde de todas
las partes de la célula, con excepción de las esporas.
• Se tiñe con el colorante rosa safranina.
Las endosporas retienen el color verde; el resto de la célula toma el color rosa.

66. Permite observar los flagelos.
• Se fija químicamente la suspensión bacteriana, mediante formol, y se hace la extensión en un
portaobjetos.
• Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno.
• Se cubre la preparación con una mezcla de ácido tánico y el colorante rosanilina, de
preparación extemporánea. El ácido tánico (mordiente) engruesa los flagelos y la
rosanilina(colorante) los tiñe.
• Se retira el exceso de colorante con agua.
• Por último, se deja secar al aire, antes de su observación al microscopio.

67. TINCIÓN DE LA CAPSULA
Y
TINCIÓN DE HISS

68. OBJETIVOS
• Definir el CONCEPTO de capsula bacteriana.
• Describir los pasos para DESARROLLAR LAS TINCIONES
mas comunes usadas para hacer visibles las capsulas bacterianas.
• Explicar la IMPORTANCIA de la capsula para la supervivencia,
identificación y virulencia de las bacterias.

69. CONTENIDO:
• ¿Qué es la capsula bacteriana?
Es una ESTRUCTURA EXTERNA a la pared celular pero
sintetizada entre la membrana celular y la pared de peptidoglicano.
 Streptococcus, Bacillus, Klebsiella, Neisseria, etc.
S. Pneumoniae causante principal
de neumonías bacterianas debe su
virulencia a su capsula.
S. mutans, S. gingivalis, S. salivaris,
son causantes de caries dentales.

70. LA CÁPSULA.
Le confiere a la bacteria su valor inmunológico.
Le impide a las células del sistema de defensa del organismo que puedan
atacarlas.
No puede ser teñida con procedimientos sencillos pero es fácil desarrollar
algunas técnicas para hacerlas visibles con respecto a la tinción de los somas
bacterianos y en contraste con el fondo de vidrio del portaobjetos.

71. TINCIONES
La Tinción negativa .
Aplicada para poner en evidencia la cápsula utilizando tinta china para teñir el fondo
y Azul de Metileno para teñir el soma bacteriano.
La Tinción de Hiss.
Utiliza una reacción de expansión de la cápsula con albúmina y el contraste contra un
fondo de sulfato de cobre tiñendo el soma con violeta cristal.

72. Tinción Negativa
1. Lave y flamee el portaobjetos y colóquelo en el puente de lavado de la tina.
2. Incinere el asa bacteriológica y enfrié.
3. Coloque una gota de tinta china en el centro del portaobjetos.
4. Seleccione una colonia y obtenga una muestra pequeña.
5. Colóquela en el portaobjetos, disolviéndola en la gota de tinta china.
6. Disuelva y disperse uniformemente en la superficie del portaobjetos para obtener una capa muy
delgada.
7. Deje secar muy bien.
8. Cubra con azul de metileno por un minuto.
9. Enjuague por un segundo y escurra. Deje secar y observe al microscopio con aceite de emersión

73. La tinción negativa facilita las observaciones
de la morfología y tamaño de las bacterias así
como la observación de la cápsula en algunas
especies bacterianas.
La cápsula es una estructura superficial mucosa,
más o menos gruesa que envuelve la pared celular
formada por polisacáridos o polipéptidos, que
confiere protección a las bacterias contra la
desecación y la fagocitosis.
A consecuencia de su elevado contenido en agua, se
tiñen débilmente por los colorantes.

74. El colorante no tiñe los microorganismos, se queda alrededor de ellos, Se usa tinta china (suspensión de partículas de
carbón coloidal) o nigrosina (colorante negro insoluble en agua) para encontrar presencia de cápsulas alrededor de
las células microbianas y micóticas, ya que este elemento no se tiñe con bases.
MECANISMO DE ACCION DEL COLORANTE
En la tinción negativa se utilizan tintes ácidos, Los tintes ácidos poseen un cromógeno negativo que no penetra la
célula de la bacteria debido a la carga negativa en la pared celular. Por esta razón la tinción lucirá como una noche
estrellada. La bacteria se verá transparente y el fondo de la laminilla del color del tinte, que en este caso, es negro.

75. TINCIÓN NEGATIVA
MATERIAL Y EQUIPO
2 portaobjetos Asa bacteriológica
Aceite de inmersión Microscopio
Mechero Cultivos bacterianos
Tinta china Franela
Cronómetro Papel seda
Guantes Puente de tinción

76. TÉCNICA1. Esterilizar el asa y enfriarla
2. Colocar una pequeña gota de agua en el extremo de un portaobjetos desengrasado
3. Esterilizar nuevamente el asa y enfriarla

77. 4. Tomar un pequeña cantidad del cultivo , con ayuda del asa hacer una extensión
sobre el portaobjetos y enseguida colocar una gota de tinta china mezclar
cuidadosamente.

78. 5. Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjeto, colocando otro portaobjeto perpendicular en ángulo
de 45 grados sobre la muestra.
6. Desplazar poco a poco el segundo portaobjeto a lo largo del primero para hacer una capa fina de la
mezcla.

79. Cryptococcus
neoformans en una
tinción con tinta china
OBSERVACIONES
Se puede observar la
cápsula
(es la capa que rodea la
esfera).
7. Dejar secar al aire.
8. Con el frotis hacia arriba, pasar 2-3 veces sobre la flama (con esto se fijaran las bacterias)
9. Observar al microscopio.

80. APLICACIÓN
En microbiología medica la demostración de la presencia de una capsula
es un medio para determinar la virulencia del microorganismo, es decir el
grado hasta el cual un patógeno puede causar una enfermedad.
Bacterias con cápsula: Klebsiella,
Pasteurella, Bacillus, Escherichia,
Haemoplhilus
Levadura con cápsula: Crytococcus
Klebsiella
pneumoniae

81. Tinción de Hiss
1. En un portaobjetos limpio, seco y flameado, coloque una GOTA DE SUERO o
de albumina.
2. Sobre ella coloque una PEQUEÑA MUESTRA de una colonia bacteriana,
disuelva y disperse sin producir chirridos en el portaobjetos.
3. Deje SECAR al aire libre.
4. FIJE con calor suavemente.
5. Cubra el frotis con VIOLETA CRISTAL AL 1% y mantenga flameado por 2 min.
6. Lave la placa con SULFATO DE COBRE AL 20%.
7. Deje secar al aire libre y observe con ACEITE DE INMERSIÓN.

82. RESULTADOS
TINCIÓN NEGATIVA TINCIÓN DE HISS