MONTAJE Y COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN

ESTANDAR DEL PROCESO DE
ATENCION AL CLIENTE - ASISTENCIAL
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ÁREA FUNCIONAL DE AYUDAS DIAGNOSTICAS
LABORATORIO CLINICO
Documento Controlado
PROTOCOLO DE TUBERCULOSIS
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TUBERCULOSIS
Micobacterium tuberculosis
La Tuberculosis constituye un grave problema de salud pública en Colombia, por
tanto se requiere de una ardua labor de todas las entidades y personas
involucradas en el control y prevención de la enfermedad. El laboratorio clínico es
fundamental en el diagnostico de esta patología.
COLORACION DE ZIEHL NEELSEN
La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y
económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M.
tuberculosis. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl
(1859 a 1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 a 1894), un patólogo.
Fundamento
El mecanismo de la ácido alcohol resistencia es doble y requiere la penetración de
la fucsina al citoplasma bacilar, así como la interacción química de los ácidos
micolicos y los péptido, glicolipidos presentes en la pared celular de las
micobacterias. Esta reacción impide la salida de la fucsina atrapada en el
citoplasma celular, cuando es expuesta a la acción del alcohol acido, lo cual
asegura la brillantez y el color rojo intenso de los gérmenes.
La Baciloscopia es la búsqueda microscópica mediante la coloración de Ziehl-
Neelsen de bacilos ácido alcohol resistentes en cualquier espécimen clínico.

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Material Requerido
 Recipiente con la muestra
 Recipiente para descartar los desechos
 Microscopio
 Aceite de inmersion
 papel de arroz
 Elementos de proteccion personal
 Laminas portaobjetos nuevas
 Cinta de enmascarar
 Esfero
 Escobillones
 Gradilla
 Papel kraf
 Agua
 frasco lavador
 Timer
 Mechero
 Fósforos
 Fucsina de Ziehl Neelsen
 Alcohol Acido al 3%
 Azul de Metileno
 Hipoclorito de sodio al 2.5%
 Soporte de coloraciones
Preparación para el extendido:

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 Lavarse las manos
 Colocarse los elementos de protección personal
 Preparación del material
 Ordenar las muestras
 Identificar los portaobjetos
 Partir el aplicador
 Seleccionar la partícula mas purulenta (útil)
 Depositar en el portaobjeto
 Extender la muestra uniformemente
 Fijar el extendido cuando este totalmente seco
 Lavarse las manos
La filtración de los reactivos utilizados se realiza, todos los domingos, los cuales
se deben rotular debidamente con fecha y numero de lote.
Estos reactivos se almacenan en una repisa dentro del laboratorio a una
temperatura de 18 a 25 C°.
Los reactivos ya utilizados en la coloración se depositan en un frasco recolector de
residuos cada mes y se lleva a cuarto de desechos en el cual Descont la empresa
recolectora de residuos los lleva para un tratamiento especial como reactivo
toxico, este frasco es rotulado con fecha de inicio, reactivo toxico, Área de
Laboratorio y se especifica reactivos.

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Muestras
ESPUTO es la muestra con mayor importancia para el diagnostico de Tuberculosis
pulmonar.
 Preferiblemente que la muestra sea la primera de la mañana o cuando el
paciente se despierte luego de haber dormido por un tiempo prolongado de
tiempo, se requiere una tos profunda para obtener el esputo en lugar de
saliva, para esto debe inspirar varias veces sin exhalar completamente, lo
que genera una cascada de tos y permite que el esputo sea expulsado
 Si aun tiene dificultad se recomienda que se acueste atravesado en la cama
recostando el abdomen sobre la almohada y trate de toser en esta posición.
 Es preferible la primera muestra matutina debido a que representa la
secreción nocturna del árbol del traqueo bronquial. Se debe realizar
enjuague de la boca únicamente con buches de agua, sin uso de crema
dental ni enjuagues bucales antes de la toma de la muestra y en condición
de ayuno.
 La muestra debe recolectarse en un frasco estéril, de boca ancha y con
tapa rosca que suministra el laboratorio.
 Debe toser profundamente y expectorar de 3 a 5 ml. de esputo en el
recipiente
 La muestra se debe recolectar en un lugar al aire libre.
 Se debe tapar herméticamente el frasco y llevarlo o remitirlo al laboratorio,
Recibir muestra rotular con nombres completos, edad, documento numero
de muestra y código asignado por el sistema gci; realizar montaje de la

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muestra según reglas establecidas, dejar secar, fijar y aplicar coloración de
ziehl Neelsen
 Nota: En caso que la muestra de positiva sea control de cualquier mes de
tratamiento o sea diagnostico se deben enviar 2 muestras refrigeradas al
Laboratorio de salud pública junto con la ficha de cultivo diligenciada por la
cara A y el resultado de baciloscopia.
Las Muestras se reciben en cualquier momento, sea de urgencias o siempre que
el paciente haya salido de la consulta se recibe la primera muestra,
(preferiblemente explicar al paciente la importancia q sea recolectada en la hora
de la mañana o luego de haber dormido un espacio prolongado de tiempo).
Las siguientes dos muestras se recogen los dos siguientes días, día 2 y día 3, de
acuerdo a las especificaciones de toma de muestra.
Nota: Si el paciente vive lejos las muestras serán recibidas el mismo día con
intervalo de una hora.
CONSERVACION
Si las muestras de esputo no van a ser procesadas en el día, deben ser
conservadas en refrigerador, preferentemente dentro de la caja de plástico. Si no
se cuenta con refrigerador, ubicarlas en un lugar fresco y protegidas de la luz.
Procedimiento de la Baciloscopia:
 Cubrir el área de trabajo con papel impregnado con hipoclorito de sodio al
2.5%, use mechero colocándolo entre las muestras y el operador.

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 Coloque las muestras de acuerdo como aparecen en el registro diario de
baciloscopia.
 Identifique la lámina con cinta de enmascarar al respaldo de la lamina, o
con laminas esmeriladas las cuales podrán ser marcadas con lápiz numero
2 de tal forma que la marca permanezca durante y después de la
coloración, con nombre completo del paciente, documento y edad, número
de baciloscopia, fecha y nombre de la institución,
 Extienda la muestra con el escobillon de modo uniforme sin llegar hasta el
borde.
 Descarte el exceso de muestra y el escobillon en el recipiente que contiene
hipoclorito de sodio al 2.5%.
 Coloque la lámina en la parte superior de una gradilla, la cual debe de estar
cubierta con papel kraff, dejar secar el extendido a temperatura ambiente.
 Una vez secos los extendidos se fijan pasándolos rápidamente sobre la
llama del mechero en 3 oportunidades, con el extendido hacia arriba.
 Colorear con Ziehl-Neelsen.
Procedimiento para la tinción de Ziehl Neelsen
 TINCION
1. Coloque las láminas sobre el soporte con el extendido hacia arriba, separadas
y con la identificación orientada hacia el operador.
2. Cubra la totalidad de la lamina con fucsina de Ziehl Neelsen previamente
filtrada
3. Caliente suavemente con la llama de un mechero, pasándolo por debajo de las
láminas hasta que se produzca emisión de vapores, evitando que esta hierva.

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4. cuando los vapores sean visibles, deje de calentar y cuando estos
desaparezcan, caliente nuevamente hasta completar 10 minutos de emisión de
vapores.
5. Si ocurre evaporación de colorantes agregue un poco mas de este.
6. Deje enfriar y lave con agua de chorro.
 DECOLORACION
1. Cubra el extendido teñido con alcohol acido al 3% durante 3 minutos
escurriendo la lamina cada 1 minuto y lave suavemente con agua de
chorro.
2. Si el extendido queda rojo vuelva a decolorar nuevamente.
 CONTRASTE
1. Cubra el extendido decolorado con azul de metileno durante 2 minutos.
2. Lave suavemente con agua de chorro.
3. Limpie la parte posterior de la lámina para retirar residuos de colorante que
puedan interferir en la lectura.
4. Deje secar a temperatura ambiente en posición vertical.
5. Realizar la lectura en 100 x con aceite de inmersión.
Luego de terminado el procedimiento de montaje y coloración, se debe proceder a
realizar la limpieza del sitio de trabajo con hipoclorito al 2.5%.
Lectura Microscópica
 Deje caer una gota de aceite de inmersión sobre el extendido

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 Al enfocar en objetivo de 100 x se observaran bacilos teñidos de color
rojo intenso sobre un fondo azul claro.
 Observe cada campo microscópico en superficie y en profundidad con
ayuda del ajuste micrométrico.
 Recorra la lámina en línea recta de izquierda a derecha por el centro
hasta el extremo. Baje o suba y regresa de derecha a izquierda.
 Registre le numero de bacilos por campo microscópico en una cuadricula
de diez por diez.
 Informe con la escala semicuantitativa
 Al terminar la lectura de cada lámina, limpie el aceite del objetivo de
inmersión con papel suave.
Nota: En caso que la muestra de positiva sea control de cualquier mes de
tratamiento o sea diagnostico se deben enviar 2 muestras refrigeradas al
Laboratorio de salud pública junto con la ficha de cultivo diligenciada por la cara A
y el resultado de baciloscopia
Luego de haber realizado la lectura de la lámina o la siembra del cultivo se
debe descartar la muestra adicionándole una solución de hipoclorito al 2.5% y
luego de 20 minutos de acción se puede desechar por vertedero y el frasco va a
caneca roja al igual que el escobillon utilizado.

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REPORTE DE RESULTADOS
RESULTADO DEL
EXAMEN
MICROSCÓPICO
INFORME
(-)
No se encuentran Bacilos Acido Alcohol Resistentes en los cien
campos observados ni en diez minutos de observación
(+) Menos de un Bacilo Acido Resistente por campo en cien campos
microscópicos observados
(++) Uno a diez Bacilos Acido Resistente por campo, 50 campos
microscópicos observados
(+++) Se observa más de 10 Bacilos Acido Resistente por campo, 20
campos microscópicos observados
CONTROL DE CALIDAD DE LA COLORACION ZIEHL NEELSEN
Se debe de realizar de forma rutinaria cada vez que se efectué la coloración de
Ziehl Neelsen, este control se monta el primer día de cada semana cuando llegue
baciloscopia, registrar el control en el registro de control de calidad de coloración
de Ziehl Neelsen.
Las láminas de los controles se realizan el último sábado de cada mes, con el fin
de tener controles disponibles, estos se marcan y se rotulan con fecha de
realización, se guardan en un lugar protegido de la luz, de tal manera que el
primer día de la semana que llegue baciloscopia se montan los controles de
calidad.

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Control Positivo
Se debe efectuar con bacilos ácido alcohol resistente de un paciente que haya
salido positivo al cual se deben realizar varias laminas fijar y guardar, en caso de
que no se tenga una baciloscopia positiva se utiliza una gota de vacuna BCG
previamente reconstituida sobre una muestra de esputo, para lo cual se pueden
realizar extendidos de baciloscopia dejar secar, fijar, rotular como control positivo y
guardar protegidos de la luz para ser usados cada vez que se utilice la coloración.
Control Negativo
Se debe efectuar haciendo extendidos de una muestras de esputo de una persona
que no sea sintomática respiratoria del cual se realizan el montaje de baciloscopia,
dejar secar, fijar, rotular como control negativo, guardar protegidos de la luz para
ser usados cada vez que se realiza la coloración.
Resultados falsos positivos
 Residuos de alimentos
 Precipitantes de colorantes no filtrados
 Fibras y polen
 Rasguños en laminas
 Transferencia de bacilos de un extendido a otro cuando no se limpia el
objetivo de inmersión entre lámina y lámina.
 Error administrativo
Resultados falsos Negativos

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1. Toma inadecuada de muestra
2. Transporte y conservación inadecuada de la muestra.
3. Selección errónea de la partícula útil para la elaboración del extendido
4. Extendidos delgados
5. Errores en la técnica de la coloración
6. Conservación inadecuada de los extendidos ya teñidos
7. Observación microscópica inadecuada
8. Error administrativo.
Guarde todas las laminas, separadas una de otra con papel suave, protegidas de
a luz y el polvo, hasta del mes que tiene asistencia técnica indirecta.
CULTIVO PARA MICOBACTERIAS
El cultivo es el método de diagnostico bacteriológico para la tuberculosis y
micobacteriosis de mayor sensibilidad. En el caso de tuberculosis pulmonar,
permite captar mas pacientes de los que se podrían captar por baciloscopia y en la
tuberculosis extrapulmonar es el mejor método de diagnostico.
La mayoría de los casos de tuberculosis son causados por Mycobacterium
tuberculosis, aunque otras especies de micobacterias pueden también causar
patologías en el hombre y se deben incluir para el diagnostico diferencial. La
utilización del cultivo permite como método diagnostico permite la identificación
posterior de la micobacteria causal. El medio de cultivo mas utilizado es el Ogawa
método Kudoh.

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Los medios de cultivo son donados por la secretaria de salud de Casanare por
tanto, el Hospital de Aguazul realiza el suministro y apoyo a otros laboratorios
privados.
Indicaciones del cultivo
 Paciente sintomático respiratorio en el cual se debe procesar la segunda
muestra de esputo con baciloscopia negativa.
 Toda muestra de paciente precedente de VIH positivo
 Tuberculosis extrapulmonar
 Tuberculosis infantil
 Paciente sintomático respiratorio contacto de un paciente con cepa
multirresistente.
 Persona privada de la libertad
 Escolar
 Personal de salud
 Albergues geriátricos
 Fuerzas militares y de policía
 Habitante de la calle
 Desplazado
 Fronterizo
 Diabético
 Con factores inmunosupresores (cáncer, quemados, trasplantados y con
tratamiento inmunosupresor)
 Desnutrición
 Embarazo

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 Enfermedad pulmonar crónica
 Farmacodependiente (Alcohol, tabaco y drogas)
Persona que fallece con TBC
 Contacto de paciente que fallece de TBC
 Para control de tratamiento
 Pacientes cuyo diagnostico haya sido por cultivo
 Pacientes quienes fracasaron al tratamiento
 Pacientes con baciloscopia control positiva de segundo mes de tratamiento
CLASIFICACION DE LAS MUESTRA PARA CULTIVO
Muestras contaminadas
Estas muestras se deben someter a un proceso de descontaminación que tiene
por objeto eliminar la flora acompañante. Las sustancias apropiadas son aquellas
que permiten la licuefacción del moco y la fibrina y destruyen los gérmenes
asociados, sin afectar la viabilidad de las micobacterias, como el hidróxido de
sodio (NaOH) al 4%.
Nota: Según lineamienrto de la Secretaria de Salud de Casanare, las muestra
numero 2 de un seriado que sea saliva no van a ser sembradas, ya que se deben
sembrar son muestras representativas como mucoide y mucopurulentas.
En caso de que salga contaminado algún cultivo se registra en la carpeta de
cultivos contaminados y se procede a llamar al paciente para una nueva muestra,
el responsable es el bacteriólogo quien haya realizado la siembra.

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Método de escobillón de Kudoh (método directo)
Este método de descontaminación, adoptado por el Laboratorio Nacional de
Referencia para la Red Nacional de Laboratorios, permite disminuir el tiempo y el
costo del cultivo frente a otros métodos existentes.
 Impregne con una capa delgada y homogénea la totalidad del algodón de
un escobillón estéril, con la partícula útil de la muestra.
 Introduzca el escobillón en un tubo que contenga 3 ml de NaOH al 4%
medido con una jeringa estéril durante dos minutos como máximo.
 Saque, sin escurrir, el escobillón y siembre con movimientos de rotación y
presión, utilizando las partes laterales del escobillón. Use un escobillón para
cada uno de los dos tubos del medio de Ogawa.
 La siembra se debe realizar por duplicado, y se rotula con: nombres
completos del paciente, cedula, edad, fecha de siembra, numero de cultivo
consecutivo del programa de TBC y nombre del laboratorio clínico que
envía.
 Incube los tubos a 37 C en posición horizontal con un mínimo de inclinación
con las tapas sin ajustar.
 Si no se tiene incubadora enviar al Laboratorio de referencia lo más pronto
posible.
 Envié el cultivo con la ficha epidemiológica correspondiente debidamente
diligenciada en las dos caras.
Luego de terminado el procedimiento de montaje y coloración, se debe
proceder a realizar la limpieza del sitio de trabajo con hipoclorito al 2.5%.

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Procedimiento de la preparación del hidróxido de sodio al 4%
- La secretaria de salud de Casanare nos realiza la donación del reactivo en
liofilizado 8 gr.
- Llega el reactivo en frasco estéril con el hidróxido de sodio al 4%, 8 gr.
- Adicionar 200 ml de agua destilada al frasco donde está el liofilizado de
NaOH 4%.
- Se revuelve hasta que se disuelva el liofilizado
- Se coloca a esterilizar por un espacio de 15 minutos a 15 L a presión por
121ºC
- Luego de esterilizado el reactivo se procede a alícuotar en tubos nuevos
estériles 3 ml de este reactivo dispensados con punta estéril.
- Se tapan con corchos estériles de los mismos tubos
- Se procede a rotular con fecha de vencimiento y de reconstitución, se debe
tener en cuenta q el reactivo reconstituido funciona un mes.
- Se guarda en la nevera a temperatura de º4.
Para el caso del Hidroxido de sodio al 4 % utilizado en la descontaminación de la
muestra de esputo, se debe descartar en un recipiente debidamente rotulado el
cual será enviado aproximadamente cada mes al cuarto de desechos para que
sea recolectado luego por la empresa descont, para que allí le haga la disposición
final ya que es un reactivo toxico.

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DESINFECCION DEL AREA DE MICOBACTERIAS.
 La desinfección se realiza todos los días, después de realizar un montaje
de muestras para baciloscopia, con una solución de hipoclorito al 2.5% por
20 minutos, pasado este tiempo retirar el exceso de hipoclorito con una
compresa limpia humedecida con agua.
 El soporte de coloraciones se debe de realizar un desinfección con
hipoclorito de sodio al 2.5 % dejar actuar por 20 minutos y luego una
limpieza con una compresa limpia y humedecida con agua
 Cada vez que se realiza montaje de baciloscopias se realiza el anterior
procedimiento, teniendo en cuenta que se coloca en el mesón un trozo de
papel kraff impregnado de una solución de hipoclorito al 2.5%, con el fin de
disminuir la contaminación del área de trabajo.
 En caso de que haya un accidente de contaminación (caída de la muestra,
ruptura de laminas o recipientes contaminados) se debe delimitar el área
contaminada luego se procede a colocar la solución de hipoclorito al 2.5%
cubrir el área con papel, dejándolo actuar por 20 minutos para que los
aerosoles se sedimente.
 En este tiempo no debe haber personal dentro del laboratorio

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 Limpie de nuevo la superficie con desinfectante, si hay ruptura de vidrio se
debe de recoger con pinzas y eliminar en el lugar correspondiente.
 Las muestras de esputo se deben descartar luego de haber realizado la
lectura de las baciloscopias y haber hecho el registro del reporte en el
cuaderno y en el sistema.
 Para el descarte de las muestras de esputo se les debe de adicionar una
solución de hipoclorito al 2.5 %, dejar actuar por 20 minutos y descartar
esta muestra en el desagüe; descartando el frasco en caneca roja
igualmente se hace para el escobillon utilizado en la decontaminacion.
 Se debe tener en cuenta que para cualquier manipulación de muestra de
esputo se debe de tener en cuenta todas las normas de bioseguridad y
tener mechero encendido, como barrera entre la muestra y nosotros.

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BIBLIOGRAFIA
 Referencia: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Subdirección de
Epidemiología y Laboratorio Nacional de Referencia. Laboratorio de
Micobacterias.
 MANUAL PARA EL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE LA
TUBERCULOSIS NORMAS Y GUÍA TÉCNICA

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