programa de brucelosis

1. Técnica de polarización fluorescente
FPA
Dr. Milton Cattáneo
Asunción 2022

2. El Brucella abortus ANTIBODY TEST KIT, FPA es una prueba semicuantitativa que utiliza la tecnología de fluorescencia polarizada para
determinar la presencia de anticuerpos en muestras de suero contra especies de Brucella que producen colonias lisas (B. melitensis, B.
abortus y B. suis).
Es una prueba homogénea que no requiere la separación de analitos y por lo tanto es rápida. Pero necesita la lectura del blanco para
cada muestras , por lo tanto es una prueba de dos pasos.
El resultados se mide en unidades de milli polarizaciones (mP).
Si anticuerpos específicos contra Brucella están presentes, (sueros positivos), el resultado será un valor alto de unidades, en ausencia de
anticuerpos (sueros negativos), el resultado será negativo. La presencia de anticuerpos indica una infección actual o reciente por
Brucella.
La prueba diagnóstica utiliza un fragmento de bajo peso molecular, de 22 Kda, del polisacarido-O (OPS) extraído de la bacteria Brucella
abortus 1119-3 y conjugado con fluoresceína.
Un instrumento de polarización por fluorescencia mide el estado de polarización de la luz emitida por el conjugado OPS
(Trazador/Antígeno). Cuando no hay anticuerpos presentes, la polarización es baja. La polarización aumenta cuando los anticuerpos se
unen al Trazador.
Fundamento de la técnica

3. Tipos de kits disponibles

4. Materiales que trae el kit
ELLIE
Control positivo 1 ml
Suero bovino positivo de Brucella abortus.
Control negativo 2 ml
Suero negativo bovino de Brucella abortus.
Diluyente/buffer de muestra 25X - 50 ml
Trazador o antígeno marcado 2.5 ml
Polisacárido de la cadena O de B. abortus 1119-3
conjugado con isotiocianato de fluoresceína.
Conservar entre 2-8 grados
Biotandil
Control positivo 1 ml
Suero bovino positivo de Brucella abortus.
Control negativo 1 ml
Suero negativo bovino de Brucella abortus.
Diluyente/buffer de muestra 20X - 60 ml
Trazador o antígeno marcado 10 ml
Polisacárido de la cadena O de B. abortus 1119-3
conjugado con isotiocianato de fluoresceína.
Conservar entre 2-8 grados

5. Otros materiales y equipos necesarios
Lector de FPA
Tubos de ensayo de vidrio de borosilicato de 10 x 75 o 12 x 75 mm para instrumentos de tubo
Micropipetas individuales de precisión y puntas para volúmenes entre 10 y 1000 μl
Timmer /vortex
Papel tissue
Agua destilada
Guantes descartables
Cofia / tapa bocas
Túnica
Descartador
Alcohol 70

6. Requisitos de la muestra
No se reciben muestras:
- hemolizadas, sin presencia de suero, no identificadas.
Se reciben muestras pero se hace un desvío:
- Poca cantidad de suero, falta de información en el registro de muestras de ampo.
Como parte del procedimiento de recepción de muestras se tiene que verificar que el registro este completo e ingresado los
datos del Veterinario responsable de la extracción de la sangre.
Una ves verificado todo se ingresa las muestras en el registro de recepción de muestras donde se le asigna un código de
ingreso utilizado por el laboratorio.
Los animales que recién abortaron no remitir sangre para diagnóstico. Esperar 28-30 días. Debido a que el microorganismo
durante este tiempo están en los órganos y no circula por sangre no generando anticuerpos. Las hembras paridas también
esperar este tiempo para la remisión de sangre. En ambos cosas pueden dar un falso negativo a las pruebas diagnósticas.
Para el diagnóstico serológico remitir sangre de vacas, vaquillonas y machos en reproducción.

7. Pasos preliminares
La temperatura de la sala debe estar a 22 °C ± 4 °C.
Preparar el diluyente de las muestras según el kit.
- Ellie: 1 mL del diluyente + 24 mL de agua destilada.
- Biotandil: 1 mL del diluyente + 20 de agua destilada.
Asegúrese de que el diluyente de muestra esté libre de partículas. Calentar hasta 37°C para disolver cualquier cristal.
Luego, equilibre a temperatura ambiente antes de usar.
Verificar que tengamos todos los materiales y equipos necesarios.
Retirar sueros y reactivos 1 hora antes de comenzar a trabajar.
Encender el equipo de FPA y el PC con la planilla Excel 1 hora antes de realizar el ensayo.
Llenar previo al comienzo de la prueba los registros y la planilla Excel con los datos correspondientes.
Identificar la corrida con la fecha, el mes y el año (ej.: 01122022). Si se realizan mas corridas en el mismo día se coloca
la letra b al final de la fecha que corresponde a la segunda corrida y así seguir el orden alfabético según cantidad
realizadas en el mismo día.
Identificar todos los tubos.
En los tubos 10x75 que se utiliza en el SENACSA utilizar la pipeta marca eppendorf, son las únicas que entran hasta el
fondo del tubo.
Vestir con cofia, guardapolvo, curbrezapatos y guantes descartables.

8. Procedimiento FPA - Ellie
1. Se utilizan como control tres sueros negativos y un suero positivo.
2. Con pipeta automática, renovando los tips por cada suero, se colocan 20 microlitros de cada muestra de suero a
diagnosticar y sueros control, en cada tubo correspondiente conteniendo el buffer.
3. Depositar en el fondo del tubo y evite las burbujas al pipetear. Evitar ensuciar el fondo del tubo, y si es necesario,
desengrasarlo con alcohol.
4. Por cada suero a procesar y los controles respectivos, se coloca 1 mililitro de buffer específico en cada tubo de
vidrio.
5. Se agita enérgicamente (Vortex) durante 5 segundos.
6. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 2 minutos como mínimo.
7. Introducir cada tubo en el polarímetro para obtener el valor blanco (colocarlos en igual posición siempre, con la
identificación para adelante).
8. Luego de retirarlos del polarímetro, adicionar con pipeta automática 10 microlitros de antígeno brucélico/trazador
en cada uno de los tubos. Depositar en el fondo del tubo y evite las burbujas al pipetear.
9. Se agita enérgicamente (Vortex) durante 5 segundos.
10. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 2 minutos como mínimo.
11. Reintroducir cada tubo en el polarímetro, en el orden correspondiente a la lectura de los valores blanco,
obteniendo así el valor final en unidades de milipolarización (mP).

9. Procedimiento de uso del equipo de FPA
• Equipo utilizado en SENACSA: Ellie – Sentry – 201
• Prender el equipo
• Abrir planilla Excel
• Llenar los datos y números de sueros.
• Lectura de blanco
• Colocar el cursor en la celda Blank II / control negativo 1
• Luego de colocar el tubo
• Presionar F3 para la lectura
• Lectura trazador/antígeno
• Colocar el cursor en la celda Tracer II / control negativo 1
• Luego de colocar el tubo
• Presionar F3 para la lectura

10. 1. Prender el equipo.
2. Automáticamente se resalta Run Assay que es la
celda que utiliza el equipo para la lectura de los
tubos.
3. No salir de Run Assay, una vez leído el blanco el
equipo automáticamente lee el
trazador/antígeno.
4. Presionar F3 en el teclado para lectura de cada
tubo.
Botón de
prender y
apagar el
equipo

11. Cálculo de resultados -Ellie
Cálculo de los valores de delta mP (ΔmP)
- Calcule los valores de ΔmP restando el valor de la muestra mP menos el promedio
de mP de los controles negativos:
ΔmP = (Muestra mP - Promedio mP de Control Negativo)
- Los resultados se clasifican en negativo, sospechoso y positivo.

12. Plate ID Tech Date Kit Serial Procedure Suspect Positive G-Factor
1 Milton 22/09/2022 Box 0617 10 20 1
Group Tag Blank || Blank ⊥
⊥
⊥
⊥ Tracer || Tracer ⊥
⊥
⊥
⊥ mP Delta mP Results
A1 Negative Control 12398 6297 162562 134735 78,0 0,6 NEGATIVE
B1 Negative Control 9840 4937 200194 167643 78,3 0,9 NEGATIVE
C1 Negative Control 11928 5971 124714 102864 75,8 -1,6 NEGATIVE
D1 Positive Control 10451 5229 144820 106011 142,8 65,5 POSITIVE
E1 1 1 9778 4649 113345 84801 127,5 50,1 POSITIVE
F1 2 2 9568 4394 133256 105836 98,8 21,5 POSITIVE
G1 3 3 9558 4574 114057 93216 82,1 4,7 NEGATIVE
H1 4 4 7221 3454 123539 100802 88,8 11,4 SUSPECT
A2 5 5 13304 6119 128290 103343 83,7 6,3 NEGATIVE
B2 6 6 9253 4406 131351 107616 83,8 6,5 NEGATIVE
C2 7 7 9329 4440 161023 132800 83,3 6,0 NEGATIVE
D2 8 8 2917 1632 112993 96660 73,4 -4,0 NEGATIVE
E2 9 9 11254 5230 111465 91555 74,4 -2,9 NEGATIVE
F2 10 10 9853 4626 113495 93639 75,9 -1,4 NEGATIVE
G2 11 11 11852 5716 114287 93681 76,0 -1,4 NEGATIVE
Positions
Sample IDs Raw Data Results
Para que la
prueba sea
válida los
controles
tienen que dar
correcto
Planilla de registro de resultados de Ellie

13. Procedimiento FPA - Biotandil
1. Se utilizan como control dos sueros negativos, dos sueros positivos y 2 control de antígeno.
2. Con pipeta automática, renovando los tips por cada suero, se colocan 10 microlitros de cada muestra de suero a
diagnosticar y sueros control, en cada tubo correspondiente conteniendo el buffer.
3. En los tubos de control de antígeno se colocan 10 microlitros de buffer.
4. Depositar en el fondo del tubo y evite las burbujas al pipetear. Evitar ensuciar el fondo del tubo, y si es necesario,
desengrasarlo con alcohol.
5. Por cada suero a procesar y los controles respectivos, se coloca 1 mililitro de buffer específico en cada tubo de
vidrio.
6. Se agita enérgicamente (Vortex) durante 5 segundos.
7. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 2 minutos como mínimo.
8. Introducir cada tubo en el polarímetro para obtener el valor blanco (colocarlos en igual posición siempre, con la
identificación para adelante).
9. Luego de retirarlos del polarímetro, adicionar con pipeta automática 10 microlitros de antígeno brucélico/trazador
en cada uno de los tubos, y a continuación agitar enérgicamente (Vortex) durante 5 segundos.
10. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 2 minutos como mínimo.
11. Reintroducir cada tubo en el polarímetro, en el orden correspondiente a la lectura de los valores blanco,
obteniendo así el valor final en unidades de milipolarización (mP).

14. Cálculo de resultados - Biotandil
El resultado final es el valor de mP.
No se calcula el delta mP (ΔmP).
El resultado se clasifica en negativo, sospechoso y positivo

15. Planilla de registro de resultados de Biotandil

16. Controles no
válidos –
prueba
rechazada
Controles
válidos –
prueba
aceptada

17. Validación de la prueba
La lectura de todos los controles debe estar dentro del rango.
En caso de que alguno de los controles salga fuera del rango, la corrida no
válida, por lo tanto se debe de repetir el ensayo.

18. Registro de resultados
Procedimiento:
- Registro de resultados en planilla de trabajo de diagnóstico serológico de Brucelosis.
- Registro en la planilla de emisión de resultados.
- Envío de resultados al SENACSA y al cliente.