la toxoplasmosis todo acerca de la enfermedad de la toxoplasmamoisis en humanos

1. IFI
“DETERMINACION DE ANTICUERPOS ANTI-TOXOPLASMA
GONDII EN SUERO HUMANO POR EL METODO DE
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA”
MODULO VII: DIAGNOSTICO PARASITOLÓGICO
DOCENTE: M.SC CARLOS EDUARDO CABALLERO BARRÓN
 Elizabeth Hurtado Justiniano
 Wily Espinoza Flores
 Yecika Alejandra Arnez Palacios
 María Eugenia Quispe Limachi
 Julia Mansilla Coronado
 Efraín Ramos Gutiérrez
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL BENI “JOSE BALLIVIAN”

2.  NOMBRE DEL KIT:
INMUNOFLUOR TOXOPLASMOSIS (Biocientifica S.A. - Argentina)

3. FUNDAMENTO
 Se basa en la capacidad de los anticuerpos de unirse a ciertos colorantes fluorescente sin alterar
sus propiedades inmunológicas.
 Si el suero testeado no contiene anticuerpos dirigidos contra ese antígeno en particular no se
formara complejo antígeno-anticuerpo y todos los componentes del suero serán eliminados en
la etapa de lavado.
Suero del
paciente
Sustrato
antigénico
Ag-Ac

4.  En el segundo paso, se agrega una antigammaglobulina humana marcada con
isotiocianato de fluoresceína. Si el complejo antígeno-anticuerpo se formó en el
primer paso, la antigamma marcada con fluoresceína se unirá a este.
 Reacción positiva, fluorescencia verde manzana brillante

5.  ESQUEMA DE LA REACCION

6. 2. REACTIVOS Y EQUIPOS NECESARIOS.
REACTIVOS
Buffer fosfato salino ph 7.2
Glicerina Tamponada con buffer
fosfato ph 8.0
Azul de Evans al 0.1%
Conjugado (antiglobulinas humanas g
y m) marcadas con isotocionato de
fluoresceina
Agua destilada o deshionizada
Antigeno, porta objeto con 12 áreas
reactivas, cada área contiene
taquizoios
Suero humano control positivo,
contiene azida sodica al 0.1%

7.  MATERIALES
MATERIALES
Tubos de kahn
Matraz aforado
Cámara húmeda
Jarras de koplin
Tips para micropipitas
Gradilla
Contenedor para deshechar
punteras
Papel absorbente
Soporte para láminas de
inmunofluorescencia
Pizeta

8.  EQUIPOS
EQUIPOS
Estufa de temperatura
regulable
Microscopio de
Inmunofluoresce
ncia.
Micropipeta 0-10 ml
Micropipeta 5-50 ml
Micropipeta 100-1000 ml
Micropipeta 50-200 ml
Reloj Cronómetro

9. 3.- Procedimiento
1. Llevar el kit de reactivo a temperatura ambiente 30 minutos antes de
realizar el ensayo.
2. Reconstituir el buffer fosfato salino (BFS) y llevar a 1 litro con agua
destilada.
3. Preparar la planilla de trabajo para inmunofluorescencia.
4. Preparar los tubos de pre dilución en gradilla y registrar código en el
primer tubo de cada serie de diluciones.
5. Utilizando marcador indeleble, identificar cada lámina con el código o
número correspondiente según el esquema de la planilla de trabajo.

10. 6. Dilución de las muestras:
para determinaciones screening hacer diluciones 1/32.
Para sueros de pacientes reactivos por HAI toxo se realiza la siguiente serie de
diluciones: 1/32, 1/128, 1/512, 1/2048, 1/8192.

11. 7. Sacar las improntas necesarias de sus respectivos envases evitando tocar las área
reactivas.
8. Utilizando como guía la planilla de trabajo para inmunofluorescencia, Colocar en la placa las
muestras y los controles descargando de 15 ul a 20 ul de muestras y de control en cada
pocillo según el esquema de trabajo que se tenga para cada jornada.

12. 9. Colocar las láminas en una cámara húmeda e Incubar a temperatura ambiente por
30 minutos.
10. Retirar de la cámara húmeda y eliminar el exceso de las diluciones con un chorro
de solución de BFS pH 7.2. Utilizando la pizeta. Evitar contaminación entre las
diferentes muestras o las diferentes diluciones en el momento de lavar las
láminas, para ello debe inclinar las láminas en ángulo de 45º durante este paso,
descartando el choro en un contenedor que tenga solución desinfectantes para
residuos infecciosos.
11. Sumergir el portaobjeto en el vaso coplin con BFS durante 5 minutos, después
escurrir y con ayuda de una pinza pasar a otro vaso coplin con BFS, sumergiendo
otros 5 minutos, agitando suavemente.
12. Preparación del conjugado: Diluir la anti gamma humana en BFS, según el título
sugerido en el frasco. Ejemplo. título sugerido 1/100 colocar 0.01 ml de anti
gamma en 1ml de BFS. (aproximadamente 200 ul por lamina)
13. Sacar los portaobjetos del BFS, sacudir todo el exceso sobre papel absorbente
manteniendo húmedas las áreas reactivas.

13. 14. La cantidad de conjugado que utilizará depende de la cantidad de láminas que
procese. Registre la cantidad de conjugado preparado y la cantidad de azul de
Evans en la planilla de uso y control de conjugado.
15. Colocar rápidamente de 15 a 20 ul de conjugado diluido en cada área reactiva,
según esquema de trabajo para cada jornada.
16. Incubar en cámara húmeda por 30 minutos a temperatura ambiente.
17. Retirar y eliminar el exceso del conjugado
18. Repetir los procedimientos que indican los puntos 10, 11 y 13.
19. Cubrir rápidamente las áreas reactivas con azul de Evans 0.1% e incubar 4 minutos
en Cámara húmeda a temperatura ambiente.
20. Lavar con cuidado el exceso de colorante con BFS, sacudir sobre papel absorbente
manteniendo húmedas las áreas reactivas colocando medio de montaje sobre el
cubreobjeto y cubrir las áreas sin presionar fuerte evitando la formación de
burbujas.
21. Para obtener buenos resultados se aconseja al leer inmediatamente En el
microscopio de fluorescencia o dentro de las 24 horas conservado de 2 a 8 °C en
la oscuridad.

14. 4. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DEL
METODO
 La prueba de IFI fue comparada con la técnica patrón de referencia Sabin
Feldmán en un muestreo de más de 7000 sueros ( Ambroise Thomas), arrojando
ambas técnicas resultados igualmente precoces sensibles y específicos.
Investigaciones posteriores confirmaron las conclusiones de Ambroise Thomas.

15.  Los factores que afectan
la sensibilidad en el
ensayo de
inmunofluorescencia
indirecta:
 El antígeno
 La dilución del suero del
paciente empleado
 Las características
espectrales y ópticas del
microscopio de
fluorescencia empleado.

16. 5. INTERPRETACION DE RESULTADOS
 CRITERIOS DE LECTURA:
 Criterio de Positividad: En caso de ser positivo se observa una típica fluorescencia verde manzana
alrededor de toda la membrana del parásito.
 Gradiente de intensidad de Fluorescencia
 La intensidad de la fluorescencia puede ser semicuantificada según la siguiente guía establecida por
el centro de Control de Enfermedades de Atlanta Georgia.
 4(+) Fluorescencia máxima verde manzana brillante
 3(+) Fluorescencia verde manzana brillante luminosa
 2(+) Fluorescencia verde manzana definida clara
 1(+) Fluorescencia verde manzana opaca pero distinguible 0 No fluorescencia o sin fluorescencia
visible

17.  Criterio de Negatividad
 a) Ausencia total de fluorescencia con predominio de la coloración del contra color
parásitos
 b) Parásitos coloreados difusamente sin presencia en la membrana
 c) Parásitos mostrando fluorescencia en 1 o ambos extremos tensión polar o bipolar
 d) Tinción despareja de la membrana del parásito.
 Determinación Semicuantitativa
 El resultado deberá informarse como la última dilución en la que se detecta una
fluorescencia verde manzana de una intensidad 1(+)
 Ojo: La fluorescencia es particularmente intensa en la membrana del parásito

18. 6. CONTROL DE CALIDAD
 Los controles positivos y
negativos deben ser incluidos
en cada ensayo. Para que el
ensayo sea válido, debe
comprobarse que los
resultados para los controles
sean correctos, caso contrario
deberá repetirse el ensayo.
7. CONCLUSIONES
 Mediante esta técnica se puede
determinar anticuerpos anti Toxoplasma
gondii el cual es mucho más importante
para para dos tipos de poblaciones:
Mujeres gestantes para un control pre
natal y determinar una infección
transplacentaria detectando una posible
infección activa gestacional en fase
aguda y para individuos
inmunocomprometidos.