Estaddo del arte sobre la modificación enzimática de la celulosa para la obtención de nanocristales.

1. Modificación enzimática de la celulosa para la
obtención de nanocristales.
Oscar Aragón Fonseca
Departamento de Madera, Celulosa y Papel, Universidad de Guadalajara, México.
Al 11 de junio del 2013
RESUMEN. El presente estado del arte trata sobre la modificación enzimática de la
celulosa para la obtención de nanocristales. Históricamente se ha reportado la
obtención de los nanocristales de celulosa a partir de hidrólisis ácida, pretendiendo
nuevas alternativas para la obtención de este producto, se ha vuelto la mirada a la
modificación enzimática. Con lo siguiente se espera proveer un panorama actual
sobre el aprovechamiento de esta técnica y los resultados obtenidos hasta la fecha en
la literatura consultada.
INTRODUCCIÓN
La celulosa es la fuente polimérica más abundante y renovable disponible en todo el planeta1. Es un
homopolímero lineal de monómeros de D-glucopiranosa ligados por enlaces β-(14)-, en principio
muy simple. La biomasa celulósica incluye a los residuos agrícolas y forestales, parte de los
desperdicios sólidos municipales, así como los cultivos herbáceos y maderables2. Típicamente, las
cadenas de celulosa en las paredes primarias de las células vegetales tienen grados de polimerización
(DP) en el rango de 5000 a 7500 unidades de monómeros de glucosa, alcanzando rangos de 10000 a
15000 en el caso del algodón. La unidad repetitiva básica de la celulosa es la celobiosa (figura 1),
disacárido de D-glucopiranosa ligado por enlaces (14)-. A temperatura ambiente, los anillos de
glucosa relativamente rígidos se encuentran en su energía más baja, conformando cadenas plegadas
4
C12.

2. Figura 1. Celobiosa, la unidad básica repetitiva de la celulosa (tomado de: Wyman, 2005).
A pesar de su simplicidad, la estructura física y morfológica de la celulosa nativa es compleja y
heterogénea. Durante la biosíntesis de la celulosa, se adhieren cadenas individuales de glucosa unas con
otras por puentes de hidrógeno y por fuerzas de van der Waals para cristalinizar y formar redes
insolubles (figura 2).
Figura 2. Cristal de celulosa I según el modelo de Meyer-Misch (tomado de: Sjöström, 1993).
Ahora se ha reconocido a la celulosa como una potencial fuente renovable para biocombustibles y
químicos de origen biológico. Su estructura sobresaliente y única hace al polímero disponible por
reacciones de funcionalización como una clase interesante y valiosa de material polimérico cuya
atracción se espera que crezca en el futuro. El descubrimiento de nuevos complejos de solutos y
solventes para la celulosa ha creado oportunidades para la aplicación de más vías de síntesis diversas y
de diferentes tipos3.

3. I. ANTECEDENTES
1.1 Generalidades
La aplicación de celulosa como precursor para realizar modificaciones químicas fue muy explotado
incluso antes
de que su naturaleza polimérica haya sido determinada y bien entendida4. Los
nanocristales de celulosa fueron descritos por primera vez por Bengt Rånby en 1949. Desde entonces la
se han reportado matrices reforzadas (compositos) con algunos polímeros como epoxi-resinas, acetato
de polivinilo, poliuretano y poliésteres. Más recientemente se han reportado el refuerzo con polímeros
hidrofóbicos, como polipropileno y poli(estireno-co-butadieno) y polibutadieno. Además, se han
desarrollado recientemente compositos a base únicamente de celulosas de diferente tipo (compositos
completamente de celulosa)5.
Bondeson y sus colaboradores reportaron, en 2006, que los nanocristales de celulosa son nanocristales
con un alto módulo de elasticidad, los cuales son preparados por la hidrólisis ácida de las fibras de
celulosa de diferentes fuentes6. De igual forma, las nanofibrillas se han aislado mediante la hidrólisis
ácida y por desdoblamiento mecánico. Los rendimientos varían dependiendo de la materia prima con la
que se esté trabajando (tabla 1)2. Mientras que la hidrólisis ácida produce nanocelulosa altamente
cristalina, la desfibrilación mecánica de las nanofibrillas
ha tenido menor cristalinidad con una
distribución bimodal de tamaños.
Predicho
Media de tamaño (µm)
Rendimiento (%)
Límite inferior
Límite superior
0.262
0.015
0.569
40.35
24.85
52.65
Tabla 1. Valores predichos con condiciones óptimas7 con intervalo de confianza de 95% (tomado de:
Bondeson, 2006)

4. 1.2 Sistemas enzimáticos
En los inicios de los 1980s, Bayer y Lamed describieron por primera vez un complejo multienzimático
en C. thermocellum, una bacteria celulítica, anaeróbica, hemofílica, que fue etiquetado como
“celulosoma”8.
Una de las aproximaciones más promisoras es la utilización de una amplia gama de enzimas
hidrolíticas existentes de manera natural las cuales actúan sobre varios polisacáridos presentes en las
paredes de las células vegetales. Estas enzimas se encuentran en numerosas bacterias y hongos con el
objeto de explotar los materiales de las plantas como una fuente nutritiva9.
Hasta el 2004, se habían identificado los codones de más de 1800 proteínas que hidroxilan enlaces
glucosídicos (glucosido-hidroxilasa). Los módulos catalíticos de las glucosido-hidroxilasas se han
clasificado en 90 familias basadas en la similitud de las secuencias9.
Las celulasas son el grupo de enzimas extracelulares incluyendo las endoglucanasas, exoglucanasas, y
β-glucosidasa. Estas enzimas actúan secuencialmente sobre la celulosa y la convierte en moléculas de
glucosa. Las exoglucanasas actúan en los extremos reductores y no-reductores de los oligosacáridos y
libera unidades de celobiosa, las cuales consisten en dos o tres unidades de glucosa. La estructura
tridimensional de los sitios activos de las exoglucanasas tiene forma de túnel circular para la
interacción con el sustrato uniéndose a los hidrógenos10 (figura 3 y 4).
Figura 3. Modelo en tres dimensiones de endoglucanasa (Tomado de: PubMed Structures).

5. .
Figura 4. Modelo en tres dimensiones de exoglusanasa, en donde se aprecia la posición en donde se
posiciona la celulosaizquierda. Aminoácidos que catalizan la hidrólisis y sitios reactivosderecha (tomado de:
Schubot, 2004).
1.3 Procesos de obtención
Hasta el 2005, mucha de la investigación se dedicó a entender el rol de las enzimas hidrolíticas de los
hongos en los procesos naturales de la degradación vegetal. El objetivo de estos procesos era la
aplicación de nuevas herramientas para el análisis directo de la biomasa, incluyendo métodos
mejorados para el uso del microscopio electrónico y del microscopio óptico para escanear campos
cercanos (NSOM) como pruebas de la acción enzimática2.
1.4 Aplicaciones
Típicamente, los humanos han empleado la biomasa celulósica para usos tales como la construcción,
estabilización de suelos, nutrición animal, y en la industria papelera. Sin embargo, las porciones de
biomasa de la celulosa y la hemicelulosa representando alrededor del 40 – 50% y 20 – 30% del peso
seco, respectivamente, son polisacáridos que se pueden romper en azúcares y ser alterados
químicamente o por fermentación para producir combustibles o químicos con valor agregado2. Los
azúcares de tales fuentes han sido utilizados para generar etanol y otros productos durante tiempos de

6. guerra con enfoques como el proceso de Scholler durante los 1940s y en economías controladas como
la que conformaba a la Unión Soviética11.
La investigación en los últimos ahora 30 años ha avanzado en la conversión biológica de la biomasa
celulósica al punto de volverse competitiva económicamente para la producción de combustibles y
químicos que tienen una importante ventaja estratégica, ambiental y económica12. Hasta el 2005, el reto
era superar el riesgo de comercializar con tecnología única en su tipo y continuar con el avance en los
procesos de hidrólisis para que los combustibles y los químicos de fuentes celulósicas fuesen
competitivos sin subsidios2.
II. ESTADO ACTUAL
Los nanocristales de celulosa (nanofibras) representan una nueva fuente biológica emergente para
producir rellenos reforzados13. El principal proceso para aislar los nanocristales de las fibras de
celulosa se basa en hidrólisis ácida. Las regiones amorfas son hidrolizadas más fácilmente, mientras
que donde las regiones que tienen una mayor resistencia al ataque ácido se mantienen intactas. Sin
embargo, siguiendo un tratamiento ácido que hidrolice la celulosa, se producen los nanocristales. Los
nanocristales obtenidos tienen una morfología y cristalinidad similar que las fibras de celulosa
originales. La ocurrencia actual del anclaje del ácido se debe a las diferentes cinéticas en la hidrólisis
de los dominios cristalinos y amorfos. En general, la hidrólisis ácida de la celulosa nativa induce una
rápida disminución en su grado de polimerización (DP)14.
Hasta el 2009 se habían utilizado las enzimas como pre-tratamiento para producir nanoestructuras de
celulosa15. Ya se había demostrado que el blanqueamiento de la celulosa aunando una combinación de
fuerzas de corte con alta presión e hidrólisis enzimática resulta en fibras a nanoescala más largas y con
mayor entrecruzamiento con diámetros en rangos de escala nanométrica. Además de ser más amigables
con el medio ambiente, esta ruta puede resultar en DP más alto de las moléculas de celulosa y mantener
el radio de aspecto, en contraste con la microfibrilación de la celulosa (MFC), un tratamiento
mecánico16.

7. 2.1 Sistemas enzimáticos.
Las celobiohidrolasas o exoglucanasas son un tipo de celulasas las cuales pueden atacar a la celulosa en
los extremos resultando en unidades de celobiosa. Las endoglucanasas hidrolizan las regiones amorfas
de manera aleatoria. En general, es necesario utilizar un paquete de celulasas y hemicelulasas que
actúan sinérgicamente en la hidrólisis de la celulosa, puesto que no se tiene una sola enzima que
degrade celulosa13. La mayoría de los métodos que usan enzimas para realizar la hidrólisis, contienen
predominantemente endoglucanasas y/o exoglucanasas. Estos procesos resultan en nanofibras en el
rango de cristales sencillos con la mayor parte de las fibras estando en fase amorfa15.
2.2 Procesos de obtención.
La producción de celulasas ha sido extensamente estudiada en los últimos años, debido a sus
aplicaciones en varias industrias. La producción de celulasas puede ser incrementada estudiando la
línea microbiana, la composición del medio y otros factores que controlan el crecimiento y la
producción. Se utilizan diferentes materiales lignocelulósicos para la producción económica de enzimas
como el maíz, el bagazo, arroz y otros17,18.
Muy pocos estudios se han concentrado en la hidrólisis enzimática seguidos por sonicación para la
producción de nanofibras de celulosa15, aunque esto es posible. Filson en el 2009, utilizó una mezcla de
múltiples componentes enzimáticos con actividad endoglucanansa predominantemente, tomando en
cuenta observaciones previas de la influencia de las condiciones experimentales tales como la
temperatura, el medio y el pH en los rendimientos de la producción de nanocristales. Estos
nanocristales tuvieron anchura de 30 – 80 nm y longitud de 100 nm – 1.80 µm sugiriendo que están
fuera del rango de la categoría de cristal solitario13.
El tratamiento de pulpa reciclada con endoglucanasas en diferentes condiciones experimentales de
temperatura, medio y pH produce nanocristales de celulosa a diferentes rendimientos. Este rendimiento
de los nanocristales de celulosa en los experimentos de Filson (2009) fueron mayores en agua y
endoglucanasas con dos diferentes métodos de calentamiento: convencional y con microondas. Para
ambos modos de calentar, el tratamiento con la enzima endoglucanasa en agua resultó en los
rendimientos más altos de nanocristales de celulosa (tabla 2)13.

8. Límite inferior
Calentado convencional
Calentado con microondas
Límite superior
28.1
29.9
35.7
40.7
Tabla 2. Rendimiento para la obtención de nanocristales en condiciones óptimas (adaptado de: Filson,
2009).
2.3 Aplicaciones.
Desde una perspectiva biotecnológica, la degradación enzimática de la celulosa es un proceso
crucialmente importante y tiene un amplio rango de aplicaciones en la industria alimenticia, la
nutrición animal, textil, combustible y la industria química19.
Los nanocristales de celulosa tienen una media de potencial zeta de -31.37 mV, una indicación de una
estabilidad favorable de los nanocristales de celulosa para un tiempo extendido. Además, la estabilidad
de suspensiones de nanocristales de celulosa en agua deionizada sugiere su idoneidad como
nanorrelleno para hacer polímeros nanocompositos de nanocristales de celulosa reforzados13.
III.
PERSPECTIVAS
Hasta el 2012 se sigue reportando
que la hidrólisis química sigue proveyendo de mayores
rendimientos, menor costo y menos consumo de materia prima aunque más agresivos con el medio
ambiente que los procesos enzimáticos. En la literatura revisada se vislumbra un método más amigable
con el ambiente para la producción de nanocristales de celulosa utilizando endoglucanasas. En un
futuro será necesario incluir enzimas específicas para romper el contenido amorfo de la celulosa para la
obtención de nanocristales a partir de las fibras y para optimizar los pre-tratamientos, tiempos y dosis
enzimáticas en la reacción, y los niveles y tiempos de sonicación.
La producción transgénica de celulasas en sistemas bacterianos podría conllevar a la generación de
bioreactores adecuados para la producción de estas enzimas. Esta proyección es una tentativa solución
a los para producción a nivel piloto de nanocristales de celulosa a partir de la hidrólisis enzimática, de

9. esta manera resultar en una aproximación como alternativa verde y económicamente competitiva,
contra la actúa producción basada en la hidrólisis ácida.
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