preparación de medios de cultivo, soluciones y reactivos.pdf

1. VC
M VIOROLOGÍA
CLÍNICA Y
MOLECULAR
Tesista: Esther Rodriguez
PREPARACIÓN DE MEDIOS
DE CULTIVO,SOLUCIONES Y
REACTIVOS
CURSO PRÁCTICO
VIROLOGÍA CLÍNICA Y MOLECULAR
PRÁCTICA 3

2. INTRODUCCIÓN
La confirmación diagnóstica de la virosis se funda en la
recuperación del agente causal, que se demuestra con el aumento
de la concentración de anticuerpos para un virus dado. Para ello,
se deben obtener los materiales biológicos necesarios para
efectuar el aislamiento del posible agente vírico y estudio
serológico.
La selección del medio de cultivo a emplear y los suplementos que
son necesarios agregar , están directamente relacionados con el
tipo de células que se van a cultivar y con el sistema que se va a
emplear en el cultivo.

3. OBJETIVOS
Adiestrar y capacitar al estudiante en las precauciones que
deben tener para la preparación de medios de cultivo,
soluciones comunes, buffers para uso en estudio de virología
RESULTADOS
1. Ser capaz de conocer la función de cada medio de cultivo,
soluciones y reactivos.
2.Saber preparar en proporciones adecuadas los medios de cultivo
y soluciones.

4. Requerimientos cualitativos de
nutrientes de bajo peso molecular
Iones inorgánicos
Aminoácidos
Carbohidratos
Mantiene el equilibrio
osmótico y regula el
potencial de membrana.
• Obligatorios en todos los medios de cultivo celular.
• Los aa esenciales son necesarios para la proliferación
de células y su concentración determina la densidad
celular máxima alcanzable.
• Los aa no esenciales estimula el crecimiento y
prolonga la viabilidad de las células.
Los carbohidratos en forma de azúcares son la
principal fuente de energía.
Ácidos grasos y
lípidos
Son particularmente importantes en medios
sin suero ya que generalmente están
presentes en el suero.
Vitaminas Esenciales para el crecimiento y
la proliferación de las
células.
Glutamina como fuente
de energía
Glucosa
Vitamina B se
agregan para la
estimulación del
crecimiento

5. Hidrolizado de
lactoalbúmina
Antibióticos y
antimicóticos
Suero en medios
Importante en los medios de cultivo celular
y sirve como fuente de aminoácidos,
proteínas, vitaminas, carbohidratos,
lípidos, hormonas, factores de
crecimiento. , minerales y oligoelementos.
Derivado de la proteína de la leche, útil
para algunas líneas celulares.
A menudo se usan para controlar el crecimiento
de contaminantes bacterianos y fúngicos
Proteínas y péptidos
Las proteínas y péptidos más utilizados son la
albúmina, la transferrina y la fibronectina. Son
particularmente importantes en medios sin
suero.
Elementos traza
Cobre, cobalto, hierro, manganeso, molibdeno, zinc,
selenio, cromo, níquel y vanadio intervienen en la
detoxificación y metabolismo aeróbico y en la
estabilización de las membranas celulares
OTROS SUPLEMENTOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PARA
CÉLULAS
Albúmina, transferrina,
aprotinina, fetuina y
fibronectina

7. Ventajas Desventajas
El suero contiene varios factores de
crecimiento y hormonas que estimulan el
crecimiento y las funciones celulares.
Falta de uniformidad en la composición del
suero.
Ayuda en la fijación de las células.
Se deben realizar pruebas para mantener la
calidad de cada lote antes de usar
Actúa como factor de propagación
Puede contener algunos de los factores
inhibidores del crecimiento.
Actúa como un agente tamponador que
ayuda a mantener el pH de los medios de
cultivo.
Aumentar el riesgo de contaminación.
Funciona como una proteína de unión.
La presencia de suero en los medios puede
interferir con la purificación y el aislamiento
de los productos de cultivo celular.
Minimiza los daños mecánicoso daños
causados por la viscosidad.
Uso de sueros en los medios
Extraído de MATER METHODS 2013;3:175

8. Tipo de medio Ejemplos Usos
Fluidos biológicos
Plasma, suero, linfa, suero de
cordón placentario humano,
líquido amniótico
Medios
naturales
Extractos de
tejidos
Extracto de hígado, de bazo,
tumores, leucocitos y médula
ósea, extracto del embrión
bovino y de pollo
Coágulos
Coagulantes o coágulos de
plasma
Soluciones
salinas
balanceadas
PBS, DPBS, HBSS, EBSS
Formar la base de
medios complejos
Medios basales MEM DMEM
Cultivo primario y
diploide
Medios
artificiales
Medios complejos RPMI-1640, IMDM
Admite una
amplia gama de
células de
mamíferos
Tipos de medios de cultivo celular
Extraído de MATER METHODS 2013;3:175

9. Soluciones de sales
balanceadas
Buffer
fosfato
de Ringer
Locke
Simas
Earle
Hank’s
Tyrode
Asegurar: pH correcto, que las sales no
sean tóxicas y la isotonicidad del producto
final
• Útiles para el lavado de células
y tejidos
• Sirven como vehículo
para el tratamiento de
células y tejidos
con varios agentes
• Proveen a las células agua y
iones inorgánicos,
mientras mantienenun pH y
presión osmótica fisiológicos
• Algunas incluyen glucosa
como fuente de energía
Algunas funciones:

10. PBS
*Diluciones, lavados celulares, de
materiales
*NaCl, Na3PO4, K3PO4
Solución de Hank’s
*Componentes autoclavable
*No necesita filtración
*Para aislamiento de virus
*Diluir virus, lavado de órganos
Solución de Earle
*Componentes, esterilizar por
filtración
*Buena capacidad bufferante
Medio de
transporte,
irrigación y
dilución
Puede
contener
Ca y/o Mg

11. Solución de Alsever
• Anticoagulante o preservativo eritrocitario
• Apoya la vida antigénica de los eritrocitos

12. Medios artificiales
• Generalmente formulados
específicamente para apoyar el cultivo
de un solo tipo de célula
Medios sin suero
o Medios de
cultivo definidos
• Contienen ingredientes orgánicos e
inorgánicos ultra puros libres de
contaminación
Medios
definidos
químicamente
• Promueven el crecimiento celular
superior y la expresión de proteínas
Medios sin
proteínas
Cultivo de células de hibridoma

13. Medios de lavado (ML)
Obtención de células renales (humanos,
bovinos, mono, etc).
Medios de crecimiento (MC)
Solución base + suplementos
• Promover
rápidamente la
proliferación celular
• Porcentaje alto de suero (10-20 %)
Medios de mantenimiento (MM)
Para conservar líneas celulares con vida
media finita
Cultivo primario de células a partir de
riñón. Células Hep 2. Fuente:
http://www.scielo.org.co/pdf/nova/v11n20/v11n
20a02.pdf
Células renales HEK 293. Fuente:
https://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulas_HEK_293
• Mantienen estado lento de
crecimiento y un metabolismo
estable durante el tiempo de la
proliferación viral
• El suero se reduce a un 1-2 %

14. VC
M VIOROLOGÍA
CLÍNICA Y
MOLECULAR
Tesista: Esther Rodriguez
GRACIAS
CURSO PRÁCTICO
VIROLOGÍA CLÍNICA Y MOLECULAR
PRÁCTICA 3

15. VC
M VIOROLOGÍA
CLÍNICA Y
MOLECULAR
ANEXOS
CURSO PRÁCTICO
VIROLOGÍA CLÍNICA Y MOLECULAR

16. MATERIALES
De vidrio Equipos y otros Sustancias químicas
Erlenmeyer de 250 mL Balanzas NaHCO3 Glucosa
Erlenmeyer de 100 mL
Autoclave
NaCl Alcohol de 70°C
Erlenmeyer de 1L Papel para pesar KCl Papel pH
Baguetas Pita gruesa MgSO4 7H2O
Agua destilada,
bidestilada
Pipetas de 1mL, 10 mL Papel Kraft NaHPO4
Rojo de fenol al
0.5%
Matraz de 1L Tijeras KH2PO4
Probetas de 100,
500mL
Equipo de
filtracion

17. METODOLOGÍA
Método A
SOLUCIONES SIMPLES
SOLUCION BUFFER FOSFATO SALINA
(PBS)
Solución 1
Cloruro de sodio (1,5 M) 87,66 g
Agua destilada 1000 mL
Solución 3
Na2HPO4 H2O 275,99 g
Agua destilada 1000 mL
Solución 2
Na2HPO4 anhídrido(2M) 283,93g
Agua destilada 1000 mL

18. Solución Stock «A» Solución Stock «B»
Cloruro de sodio
(1,5 M)
100 mL Cloruro de sodio
(1,5 M)
100 mL
Na2HPO4
anhídrido(2M)
100 mL Na2HPO4 H2O
(2M)
100 mL
Agua destilada 100 mL Agua destilada 100 mL
SOLUCIÓN DETRABAJO
Solucion Stock A……………………………………………………………………….22 mL
Solucion Stock B……………………………………………………………………….78 mL
Mezclar
Esta solución se usa como diluyente de los hematíes
Cuando se combina en volúmenes iguales con soluciones borato-salina albúmina bovina al 0,4%
y a pH 9,0 da como resultado una solución buffer fosfato albúmina bovina a pH 6,2.
Solución 1
Solución 2 Solución 3

19. Método B SOLUCIÓN BUFFER FOSFATO SALINA
(PBS)
Solución A
NaCl 8,0 g
KCl 0,2 g
CaCl2 2H2O 0,132 g
MgCl2 6H2O 0,1 g
Agua destilada 800 m L
Solucion B
Na2HPO4 1,15
K2HPO4 0,2
Agua destilada 200 mL

20. SOLUCIÓN BUFFER FOSFATO
SALINA (PBS)(2)
Solución
NaCl 1.6 g
KCl 0.04 g
Na2HPO4.7H2O 0.23 g
KH2PO4 0.04 g
Agua destilada 200 m L
SOLUCIÓN SALINA
NaCl 0.9 g
Agua destilada 100 m L

21. SOLUCIONES DE SALES
BALANCEADAS
SOLUCIONES BALANCEADAS DE HANKS (BBS) 10X CONCENTRADO
SOLUCIÓN DE
HANKS
Solución 1
NaHCO3 3,5 g
Agua destilada 250 mL
Autoclavar a 120°C por 15 min en
tubos tapa rosca
Solución 2
NaCl 8,0 g
KCl 4,0 g
MgSO4 7H2O 2,0 g
Na2HPO4 2H2O 0,6 g
Glucosa 10,6 g
KH2PO4 0,6 g
Agua destilada 800 mL
Solución 3
CaCl2 1,4 g
Agua destilada 100 mL
Solución 4
Rojo de fenol 0,4 g
Mezclar con una pequeña cantidad de
agua hasta que forme una pasta
Diluir a 15omL con agua destilada,
titular a un pH 7,0 con NaOH. Llevar a
un volumen final de 200mL.
Preservar con cloroformo 1-2mL

22. 100 mL solución 4 800 mL solución 2 900 mL solución 2+4
900 mL solución 2+4 100 mL solución 3
1000 mL solución Stock 10X
Agregar 3-4mL de cloroformo
Guardar a temperatura ambiente

23. SOLUCIÓN DE
HANKS SOLUCIÓN DETRABAJO DE HANK’S
Solución Stock 10X Agua destilada
1 : 10
Distribuir en botellas
Autoclavar a 120°C por 15 min
Añadir asépticamente 2,5 mL de PBS;
ajustar pH. Burbujear con CO2 de ser
necesario

24. SOLUCIÓN
EARLE SOLUCIÓN 1: DE SAL BALANCEADA EARLE (1X)
SOLUCIÓN 1: DE SAL
BALANCEADA EARLE (1X)
NaCl 6,8 g
KCl 0,40 g
MgSO4 0,10 g
NaH2PO4 0,125 g
NaHCO3 2,2 g
Glucosa 1,0 g
Agua destilada 1000 mL
Solución 2
CaCl2 1,0 g
Agua destilada 10 mL
SOLUCIÓN DETRABAJO
Esterilizar por filtración
SOLUCION DETRABAJO
Solución 2 2 mL
Agua destilada 200 mL
Solución 1 100 mL
Completar con agua destilada hasta 1000mL
pH ajustar burbujeando CO2 7,4
Todas las cantidades son dadas para
sales anhidras, cuando las formas
hidratadas son usadas se deben ajustar
las cantidades de acuerdo a esto.

25. SOLUCIÓN
ALSEVER
Dextrosa 20,5 g
NaCl 4,2 g
Citrato de Na 2H2O 8,0 g
Ácido cítrico 0,55 g
Agua destilada 1000 mL

26. MEDIO RPMI
RPMI
RPMI 1640 10,4 g
NaHCO3 2,0 g
L-Glutamina 0,3 g
Agua destilada 1000 mL
MEDIO DE
CONGELACIÓN
Criopreservador
(DMSO)
10 %
Suero Bovino Fetal 60 – 70 %
Medio base de
crecimiento
20 -30 %