Manual de Técnicas Analíticas en el laboratorio forense Capítulo 11

1. Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología
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Manchas de Semen
Autor:
Dr. Rodolfo Nieto, Perito del Laboratorio de Toxicología y Química Legal de la Asesoría Pericial dependiente
del Poder Judicial de la Provincia de Buenos Aires.
Introducción
En los casos de violación es común contar con muestras de semen secas asentadas sobre diversos
soportes, o bien hisopados obtenidos de la víctima. A su vez, este tipo de delitos sexuales,
constituyen un grupo de hechos sumamente difíciles de comprobar, de allí, que el procesamiento de
los materiales citados adquiera gran importancia ya que con las técnicas actuales podría demostrarse
de manera fehaciente la intervención de un determinado individuo.
Se define el esperma como un líquido compuesto por dos fracciones, el líquido seminal y los
espermatozoides, revistiendo ambos gran importancia desde el punto de vista pericial.
En el primero encontramos bases orgánicas tales como la colina, la espermina y la espermidina,
sustancia este última a la cual debe su olor el esperma. También posee en su composición proteínas
entre las cuales se pueden mencionar, por su importancia, la fosfatasa ácida prostática, el antígeno
prostático específico (PSA), la fosfoglucomutasa (PGM), peptidasa A (Pep A) y la Glioxilasa I (Glo I).
Debe mencionarse también la presencia de sustancias similares a los antígenos del sistema ABO, los
cuales estarán presentes en aquellos individuos secretores y que permitirán la determinación del
mismo en este fluido. En tal sentido, se conoce que entre el 75 y el 80% de la población tiene esta
característica y, por lo tanto, todos sus fluidos corporales contienen este tipo de sustancias.
1. Estudio de las manchas de semen
Un modo práctico para el estudio de las manchas de semen es el que se detalla en el siguiente
cuadro:
Visual
Localización Táctil
U.V.
¼ de hisopo o ½ cm2 de mancha Mancha o hisopo
+ 250 l de Solución Fisiológica
visualización de espermetazoides
centrifugar a bajas revoluciones (2.000 rpm)
ABO
Sobrenadante Pellet
Fosfatasa ácida prostática (FAP) Observación microscópica PGM – Pep A
PSA
2. Localización de la mancha
Las manchas de semen pueden presentarse sobre diversos soportes pero, los más comunes son
la ropa interior de la víctima y las prendas de cama. Un dato a tener en cuenta serán las
características del material a examinar, entre las cuales se destaca la capacidad de absorción del
mismo, su color, etc.
De todos modos, en general, puede decirse que las manchas de semen presentan un color blanco
grisáceo que va tornando hacia el amarillento con el paso del tiempo, adquiriendo, en especial
sobre las telas, una consistencia apergaminada, característica que resulta de utilidad para su
ubicación por medio del tacto. El empleo de luz U.V. constituía un método práctico para localizar
este tipo de manchas, pero los daños que ésta puede causar al material genético ha hecho que
caiga en desuso. La misma se basaba en la propiedad fluorescente de las manchas de esta clase.
3. Observación de Espermatozoides
La visualización de espermatozoides completos constituye, por sí sola, la única prueba irrefutable
de la presencia de semen en una mancha.
De allí que, previo a detallar las técnicas a emplear para tal fin, es importante repasar
someramente su estructura. Los espermatozoides son células móviles compuestos básicamente
por cabeza (en la cual se encuentra el núcleo), cuello, cuerpo y cola. Su longitud oscila entre 40 y

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50 m, mientras que con respecto a su forma la cabeza, vista de frente, es oval, mientras que de
perfil es aguzada (Fig. 11.1).
Fig. 11.1: espermatozoide
Para su estudio, tal como puede verse en el esquema precedente, hay dos posibilidades. Una de
ellas es trabajar directamente sobre el material motivo de pericia y la otra sobre el pellet obtenido
en la centrifugación de un macerado en solución fisiológica de la mancha a estudiar. Cualesquiera
sea la metodología empleada, un hecho para tener en cuenta es que los espermatozoides son
elementos sumamente lábiles, de modo tal que la cabeza y la cola se separan muy fácilmente. De
allí que múltiples factores que hacen a la conservación de la muestra dificultan, cuando no
imposibilitan, la observación de estos elementos en forma completa. Paralelamente, esto implica
un sumo cuidado en el procesamiento del material a estudiar.
Por otra parte debe tenerse en cuenta que ciertas enfermedades afectan, de forma diversa, la
cantidad de espermatozoides que produce un individuo. Así, en la oligozoospermia, su
concentración está disminuída, mientras que en la azoospermia no se encuentran presentes en el
semen.
 Visualización directa: para tal fin, un trocito de la mancha en estudio se coloca en el
centro de un portaobjetos, adicionando sobre el mismo una gota de solución
fisiológica y otra de una solución al 0,5% de eritrosina en NH3 al 5% y se comprime
el material con ayuda de dos agujas de disección, con el objeto que los componentes
de la mancha pasen a la solución. Luego se retira la muestra, se coloca un
cubreojetos y se observa al microscopio con ocular de 40X. Los espermatozoides se
verán con la cabeza teñida de color rosa.
 Visualización previa centrifugación: en este caso, y tal como se indica en el esquema,
se emplea el sedimento de la centrifugación de un macerado de la mancha en
solución fisiológica.
Para tal fin, ¼ de un hisopo o un cuadrado de 0,5 cm de lado de tela manchada se coloca en un
tubo de centrífuga al cual se adicionan 250 l de solución fisiológica. Luego, con sumo cuidado, se
presiona el material contra las paredes del tubo con ayuda de una varilla de vidrio a fin que el
material presente en el mismo pase a la solución.
Posteriormente, de retira el material presionando de modo tal que escurra el líquido casi en su
totalidad. Luego se centrifuga a baja velocidad (1.500 a 2.000 rpm) durante 3 a 5 minutos. El
sobrenadante se transfiere con sumo cuidado a otro tubo y sobre el sedimento se procede a
investigar la presencia de espermatozoides, previa resuspensión del mismo agitando suavemente,
empleando la coloración descripta precedentemente.
En ese sentido, diversas son las técnicas que pueden utilizarse, siendo una de ellas la
desarrollada por I.C. Stone.
Para ello se prepara las siguientes soluciones:
a) Solución Kernechtrot; disolver 5g de Al2(SO4)3 (grado analítico) en 100 ml de agua
destilada hirviendo. Inmediatamente adicionar 0,1g de Nuclear Fast Red y agitar con ayuda
de una varilla de vidrio. Enfriar y filtrar a través de papel de filtro. Esta solución es estable
de 3 a 6 meses a 8ºC.
b) Solución picroindigocarmín (PICS); adicionar 4g de ácido pícrico (grado analítico) a 300 ml
de agua destilada, en un vaso de precipitado. Tapar el recipiente y dejar durante toda la
noche a temperatura ambiente a fin de obtener una solución saturada. Luego disolver 1g

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de Índigo-carmín, filtrar y guardar. Unos pocos cristales de ácido pícrico pueden
permanecer en la solución.
Procedimiento: una gota del pellet se coloca en un portaobjetos y se adiciona sobre ésta una
gota de solución a), dejando 15 minutos debajo de un vaso de precipitado adecuado (600 ml)
invertido. A continuación, con una pipeta limpia adicionar en un lateral del portaobjetos 1 – 2 gotas
de agua deionizada de modo tal que no toque la mezcla. Inclinar con cuidado el portaobjetos y
quitar el excedente con papel de filtro. No tocar el área original de la gota muestra con el papel.
Repetir esta operación hasta que el agua de lavado resulte incolora.
Luego, agregar una gota de la solución b) sobre el sector donde se había colocado la muestra y
emplear la misma técnica de lavado descripta anteriormente, pero empleando etanol absoluto. Al
observar al microscopio, los espermatozoides se visualizarán teñidos de la siguiente manera: la
cabeza de color rojo, la parte central roja y verde y la cola de color verde. De existir células de la
mucosa se observarán teñidas de color azul con su centro rojo.
En muestras mal conservadas los espermatozoides pueden aparecer pálidos o descoloridos e,
inclusive, de una tonalidad verdosa o violeta. Debe tenerse presente que éste fenómeno también
puede ocurrir en casos de sobrecoloración con la solución b).
Si los espermatozoides no se observan completos, el autor refiere que pueden reconocerse las
colas, aunque debe recordarse aquí la importancia, por el grado de certeza, de observar estos
elementos completos. Una variante más sencilla de realizar esta técnica es la siguiente: una gota
del sedimento se fija a un portabjetos mediante la acción del calor (30 minutos a 60ºC).
Luego, cubrir el preparado con una gota de Nuclear Fast Red y dejar al menos 10 minutos. Lavar
con agua destilada. A continuación, adicionar una gota de picroindigocarmín y rotar el preparado
durante 15 – 30 segundos (pero no más). Lavar con etanol, secar y observar a 400X, usando
aceite de inmersión de ser necesario.
Otras metodologías a emplear serían Papanicolau, May Grünwald – Giemsa, azul de Loeffler, etc.
Cualesquiera fuera la metodología empleada, se coloca una gota del sedimento en un
portaobjetos, se hace un extendido y se lo deja secar al aire, pudiendo recurrir eventualmente y
con precaución, a una fijación con ayuda de calor muy suave.
4. Fosfatasa ácida prostática
Como hemos dicho anteriormente, los espermatozoides son elementos sumamente lábiles, motivo
por el cual en los Laboratorios Forenses resulta muy frecuente no poder observarlos completos. A
este hecho debe sumarse que, tal como se mencionó anteriormente, diferentes patologías pueden
disminuir su número e incluso estar ausentes en el fluido seminal.
Es en estos casos cuando evidenciar la presencia de semen se torna más dificultosa aunque,
diversos marcadores, permiten arribar con un grado de certeza muy importante a tal objetivo.
Para tal fin se debe demostrar en la mancha la existencia de componentes habituales del plasma
seminal, tales como colina, espermina, fosfatasa ácida prostática (FAP) y el antígeno prostático
específico (PSA), siendo los dos últimos los más empleados hoy en día.
Para ello, se puede trabajar con el sobrenadante de la centrifugación o bien con el líquido
obtenido luego de adicionar al material en estudio solución fisiológica. La primera alternativa
posee como ventaja la “limpieza” de la solución a emplear.
La FAP es una enzima presente en el semen en concentraciones tan elevadas como en ningún
otro fluido biológico. Si bien es cierto que la misma no se encuentra exclusivamente en dicho
fluido, la característica enunciada sumado a que es inhibida por el ácido L (+) tartárico, han
permitido el desarrollo de técnicas destinadas a su investigación.
Una de ellas es la de Sivaram la cual por su practicidad, rapidez, sencillez y la posibilidad de
realizar varios ensayos simultáneamente, resulta de suma utilidad para el estudio de esta enzima.
Los reactivos a emplear son los siguientes:
 Buffer citrato-cítrico pH 4,9: disolver 1,89 g de ácido cítrico monohidrato en 50 ml de H2O
destilada. Adicionar a la solución resultante 18ml de NaOH 1 N y 10 ml de HCl 0.1 N, ajustando el
pH a 4,9. Completar a 100 ml y conservar en heladera.
 Tartrato de Sodio 0,4 M: disolver 0.6g de ácido L (+) tartárico en 5 ml de agua destilada y
luego adicionar 3.5 ml de NaOH 2 N. Ajustar el pH a 4.9 y completar el volumen a 10 ml con agua
destilada. Conservar en heladera.
Los reactivos siguientes se deben preparar en el momento de usar:
 Reactivo I: alfa-naftil fosfato disódico (5 mg) se disuelven en 5 ml de buffer citrato y a
continuación se le adicionan 5 mg de Fast Blue B. Disolver.
 Reactivo II: 5 mg de alfa-naftil fosfato disódico se disuelven en 4,5 ml de buffer citrato y
0,5 ml de tartrato 0,4 M, adicionando, a continuación, 5mg de Fast Blue B.

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Observar que la diferencia entre los dos últimos reactivos consiste en la presencia del inhibidor en
el segundo de ellos.
También se cuenta con reactivos comerciales.
4.1 Ensayo de orientación
El mismo tiene como utilidad descartar, o no, la presencia de la enzima en el material en estudio.
Para su realización, la mancha se comprime con un papel de filtro húmedo y se adiciona sobre el
mismo gotas del reactivo I que de ser positivo, se observa en forma prácticamente inmediata, la
aparición de un color púrpura.
Es aconsejable la realización de un ensayo en blanco empleando para tal fin un sector no
manchado del material en estudio. El mismo tiene por objeto descartar la presencia de
interferencias.
4.2 Ensayo de confirmación
En caso de obtener resultado positivo en el ensayo precedente, se procede a efectuar la prueba
definitiva, la cual se realiza de la siguiente manera: en el primer pocillo de una policubeta de Kline
se coloca una gota de solución obtenida de modo similar a aquella del material en estudio, pero
empleando una zona del mismo no maculada (blanco).
En los dos pocillos contiguos adicionar una gota del macerado o sobrenadante en estudio (ver fig.
11.2)
Fig.11.2 1 gota blanco 1 gota muestra problema
Posteriormente, se adiciona a los dos primeros pocillos una gota del Reactivo I y, al tercero, una
gota del Reactivo II. Al cabo de un minuto, aproximadamente, deberá observarse la aparición de
un color púrpura en el segundo pocillo, permaneciendo inalterables los otros dos en caso de una
reacción positiva, mientras que de ser negativa no se observará la aparición de dicha tonalidad.
Eventualmente, puede apreciarse una cierta tonalidad en el tercer pocillo, pero su intensidad
deberá ser considerablemente menor que aquella del primero. Este hecho se debe a que la
concentración de la enzima presente es muy elevada y por lo tanto, rebasa la capacidad inhibitoria
de ácido L (+) tartárico. De todos modos, el primer pocillo deberá permanecer siempre inalterable,
ya que la aparición de color indicará la presencia de algún tipo de interferencia originado en el
soporte de la mancha.
5. Antígeno Prostático Específico (PSA)
Este marcador consiste en una glicoproteína intracelular (PM 34.000 dalton), sintetizada
exclusivamente por la glándula prostática, siendo, por lo tanto un componente normal del plasma
seminal.
Para su estudio pueden emplearse diferentes metodologías, entre las cuales el kit comercial
“PSA-check 1” provisto por la firma Veda-lab ofrece muy buenos resultados, siendo además un
método práctico y rápido.
Se trata de un ensayo inmunocromatográfico, el cual emplea una única combinación de conjugado
colorante-anticuerpo monoclonal y anticuerpo policlonal en fase sólida, permitiendo así identificar
el antígeno con un aceptable grado de sensibilidad (límite de detección 4 mg/ml).
De este modo, el antígeno se combina con el anticuerpo monoclonal, fluye por la placa por
capilaridad y se combina con los anticuerpos anti-PSA fijos, originando un complejo coloreado
visualizado en forma de banda, que indicará una reacción positiva.
Técnica: 5 gotas (aproximadamente 250l) del macerado de la mancha o del sobrenadante
se dejan caer en el sector de la placa destinado a tal efecto, se deja unos 10 minutos y luego se

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lee el resultado. La aparición de dos bandas de color indicarán una reacción positiva mientras que
la aparición de una sola banda indicará un resultado negativo (fig.11.3).
Sector agregado macerado banda control banda que indica presencia de PSA
Fig. 11.3: determinación por inmunocromatografía de PSA (Veda-lab)
La banda control debe observarse en todos los casos, ya que de no ser así, indica la existencia de
algún inconveniente, siendo aconsejable repetir la prueba empleando otra placa.
Electroforesis empleando anti-P30:
La proteína P30 es una glicoproteína característica del semen y cuyas características coinciden,
exactamente, con aquellas del antígeno prostático específico, no obstante lo cual será designada
con el nombre de la técnica original.
El antisuero empleado, anti-P30 provisto por los Laboratorios SERI, es específico de P30 y no
muestra reacción cruzada con ningún otro fluido corporal. Este reacciona con máxima sensibilidad
(semen diluido 1:3.000) usando la técnica de cross-over y de allí que sea la misma la aconsejada.
Un hecho a tener en cuenta, es que la proteína a investigar está formada por cuatro fracciones y
se requiere, por lo tanto, una correcta combinación de los valores de endosmosis y pH para que
las mismas permanezcan unidas.
Reactivos:
 Buffer de corrida: disolver 25,2 g de Tris base más 2,5 g de EDTA (libre de ácido) y 1,9 g
ácido bórico en 1 litro de agua destilada. Ajustar a pH 9,1 con solución de NaOH al 20%.
 Buffer Gel: Idem buffer de corrida.
 Gel de Agarosa 1%: disolver 0,08g de Agarosa en 8ml de Buffer Gel
 Coomassie Blue 0,2% disolver el colorante en una mezcla de solventes formada por: 50 ml
de metanol, 50 ml de agua y 10 ml de ácido acético.
Procedimiento:
Emplear placas de 3 x 2 pulgadas (1 pulgada = 2,54 cm). Con un sacabocados realizar hoyuelos
en la placa tanto del lado anódico como catódico y sembrar el antisuero y las muestras y testigos
del segundo.
Varios autores aconsejan el empleo de testigos de semen y flujo vaginal, pudiendo mencionarse
que los Laboratorios SERI proveen estándares de semen (SERI lyophilized semen – std – R563).
La corrida electroforética se realiza a temperatura ambiente y bajo las siguientes condiciones:
voltaje 120 V durante 20 minutos. Luego, leer con luz reflejada sobre un fondo oscuro. La lectura
puede completarse de la siguiente manera: lavar la placa en una solución salina 1 Molar durante
toda la noche. A continuación cubrir con papel de filtro Wahtman Nº1 y secar a 60ºC.
Luego emplear una solución colorante de Coomassie Blue al 0,2% sumergiendo la placa durante
15 minutos. Lavar con solución salina 1M hasta que el fondo sea claro.
6. Determinación de Grupo ABO en manchas de semen
Una vez establecida la presencia de semen, el paso siguiente es la determinación del grupo
sanguíneo ABO y luego de las isoenzimas PGA y Pep A. Si bien es cierto que las modernas
metodologías para estudio del ADN han superado ampliamente (por su poder de discriminación) a
las técnicas mencionadas, el autor considera que, al menos en lo que respecta al estudio del
grupo, sigue constituyendo por su simplicidad y costos, una interesante alternativa que permite
descartar a un sospechoso.
En ese sentido, un hecho de fundamental importancia será la cantidad de muestra disponible de la
que dependerá, por razones obvias, cuales serán las pruebas a efectuar.
En cuanto a la presencia de los antígenos ABO en plasma seminal, fue establecida por Yamasani
y Shirai (1926), siendo el título de los mismos igual o mayor que aquel observado en saliva.
La tipificación de individuos secretores mediante la técnica de absorción – inhibición (ver capítulo
Manchas de sangre) no resulta dificultosa y ofrece buenos resultados, mientras que aquella de
absorción – elución puede arrojar falsos negativos para la presencia de un antígeno. Esta
situación se debe a que las sustancias secretadas son solubles y, por lo tanto, podrían ser
eliminadas en los pasos de lavado. Por tal motivo, la última de las técnicas no es aconsejable para
procesar este tipo de muestras.

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Un hecho a tener muy en cuenta en la interpretación de los resultados obtenidos, deriva de la
siempre posible contaminación del semen presente con flujo vaginal (lo cual ocurre
invariablemente en hisopados vaginales) y/o sangre de la víctima.
En ese caso, algunos autores desaconsejan la determinación del grupo y, de efectuarlo, tener muy
presente que, en el resultado obtenido, bien pudo haber influido la presencia de dichos fluidos.
Resultando de suma utilidad el conocimiento del grupo sanguíneo de la víctima y, de ser posible,
el del sospechoso, al igual que el carácter secretor o no de los mismos.
7. Otras determinaciones
Dos sustancias cuya determinación suele investigarse en el análisis de manchas de semen, ya
sea por que son solicitadas por la instrucción o bien por la influencia que en los resultados de las
pericias podrían tener, son la saliva y la materia fecal.
7.1 Investigación de saliva
Si bien la misma no posee un marcador característico, una elevada concentración de la enzima
amilasa sugeriría la presencia de este fluido.
Reactivos:
 Buffer pH 6.9: disolver 2,7 g de NaPO4H2 más 3,9 g de Na2PO4H y 0,2 g de NaCl (7 mM)
en 500 ml de H2O deionizada
 Gel: disolver 0,1g de agarosa y 0,02g de Almidón soluble en 10 ml de Buffer pH 6.9
Procedimiento:
Volcar la solución del gel en una cápsula de Petri plástica de 15 x 100 mm y dejar en reposo hasta
que se forme el gel. Luego practicar en el mismo, con ayuda de una Pipeta Pasteur o similar,
hoyuelos separados por una distancia de, al menos, 1,5 cm y luego sembrar las muestras y
controles con cuidado de no rebalsar los orificios. Los últimos pueden ser, por ejemplo, saliva sin
diluir y en diluciones 1:500 y 1:1.000, los cuales, además, servirán para tener una idea
aproximada de la concentración de saliva en la muestra en estudio, a partir de la medida de los
diámetros obtenidos.
Tapar la cápsula e incubar a 37ºC toda la noche. Luego adicionar a la placa una dilución 1:100 de
una solución de yodo saturada. La presencia de círculos claros en torno a un hoyuelo indica
reacción positiva para la presencia de la enzima en la muestra en cuestión.
7.2 Investigación de materia fecal
Para tal fin, se analiza la presencia de urobilinógeno. Este test se basa en la formación de un
complejo verde fluorescente zinc – urobilina. El urobilinógeno es oxidado a urobilina la cual es
soluble en alcohol, y así, en presencia de una sal neutra de zinc en solución alcohólica se forma el
mencionado complejo.
Procedimiento: preparar un extracto acuoso de la mancha en un tubo pequeño. Colocar la misma
cantidad de agua en un segundo tubo como control. Adicionar a cada tubo 3 gotas de una
solución saturada de cloruro mercúrico en etanol.
Adicionar un volumen igual de una solución saturada de cloruro de zinc en etanol y agitar. Luego
observar bajo luz U.V. Una fluorescencia estable de color verde indica la presencia de
urobilinógeno.

7. Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología
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