El documento describe un experimento para identificar las enzimas citocromo C y succinato deshidrogenasa en mitocondrias. Estas enzimas son marcadoras de la mitocondria. Se preparan tubos con diferentes combinaciones de succinato de sodio, cianuro de potasio y homogenado hepático. Luego se mide la absorción a 550 nm para identificar la presencia de citocromo C reducido, indicando la actividad de estas enzimas mitocondriales.

1. PRACTICA 6 NUCLEO
Objetivo: el alumno identificará la estructura del núcleo en interfase.
Introducción.
El núcleo en interfase es un compartimiento celular delimitado por dos membranas interrumpidas
por poros que contienen el material genético constituido por el ácido desoxirribonucleico (ADN), y
los componentes para la transcripción de la información genética en ácido ribonucleico (ARN),
para su procesamiento y duplicación del ADN. La presencia o ausencia del núcleo como
compartimiento es uno de los criterios para separar las células en procariontes y eucariontes.
Con el microscopio óptico se pueden distinguir diversas estructuras, la envoltura nuclear, el
nucléolo, grumos de cromatina, un espacio no ocupado por el nucléolo ni la cromatina
compactada; a este espacio se le llama región intercromatiniana. Desde 1949 Barr y Bertram,
observaron que en neuronas de gatos hembras, la presencia de una masa que se teñía
intensamente en el núcleo de estas células en interfase. A partir de 1951 Barr reconoció que esta
masa no estaba relacionada con el nucléolo, como al principio se consideró; y se asoció con el
sexo femenino, denominándolo como cromatina sexual y corpúsculo de Barr y actualmente se
conoce como cromatina X.
El estudio de la cromatina X empezó a formar parte de los estudios citogenéticas, cuando se
comprobó que podía demostrarse en diferentes tejidos y observarse en frotis de mucosa bucal o
linfocitos de sangre periférica. Cuando surgieron las técnicas para el estudio de los cromosomas
humanos, se encontró una estrecha relación entre la presencia del corpúsculo de Barr y el número
de cromosomas X.
Material y Equipo.
Meristemos (raíces) de Allium cepa de 3 a 4 cm Células de epitelio bucal
Portaobjetos y cubreobjetos
Estuche de disección Lámpara de alcohol
Orceína acética al 2%
Alcoholes: absoluto, 96°, 70° y 50° HCl 1M, Ácido acético al 45%
Método para meristemos.
Preparaciones temporales
1. Cortar 1cm de la parte terminal de las raíces y colocar en vidrio de reloj con orceína acética.
Cuidar que los meristemos queden perfectamente cubiertos con el colorante.
2. Calentar a la llama de la lámpara de alcohol, retirar al desprender vapores, enfriar y volver a
calentar suavemente por 2 o 3 veces. Cuide que el colorante no entre en ebullición los
meristemos se dañan y usted daña el aparato respiratorio porque respira ácido acético.
3. Enfríe y transfiera cada una de las raíces a un portaobjetos, corte 2mm desde el ápice,
añada una gota de orceína y coloque encima el cubre, presione con la punta de la goma
del lápiz la zona donde se encuentra el meristemo y mediante golpes con la g9oma del lápiz,
disperse hasta tener una monocapa, con papel kleenex, quite el exceso de colorante.
4. Observe al microscopio a 10X y 40X.
Método para cromatina sexual Cuerpo de Barr.
1. de enjuagar varias veces la boca con el agua, tome por raspado suave con abatelenguas,
una muestra de epitelio bucal y coloque en portaobjetos perfectamente lavados y sin grasa,

2. coloque la muestra y haga un frotis. Cada equipo debe tener mínimo una muestra de células
de mujer y de hombre.
2. Hidrolice con HCl 1N por 30 segundos y absorba rápidamente el ácido y tiña con
Acetorceína.
3. Lave con ácido acético por goteo, cubra con un portaobjetos y selle con barniz. Observe el
microscopio a 100X.
Resultados.
Primer campo Segundo campo Tercer campo Cuarto campo Quinto campo
Interfase 10 Más de 10 Más de 4 Más de 7 Más de 5
Profase 5 2 3 2 1
Metafase 1 1 0 2 0
Anafase 0 3 0 0 1
Telofase 1 0 1 0 0

3. Práctica 14 Citoesqueleto: Movimiento ciliar.
Objetivo: observar en condiciones fisiológicas y de cambios temperatura y bloqueadores de la
cadena respiratoria el movimiento ciliar de Crasostrea spp.
Introducción.
El Citoesqueleto está formado por cuatro componentes fibrilares: microfilamentos, filamentos
intermedios, microtrabéculas y microtúbulos, que están presentes en el citoplasma de células
eucariontes, ayudan al soporte y participan en el desplazamiento de moléculas y organelos.
Los microtúbulos formados por la proteína tubulina, intervienen en diversas funciones tales como
transporte intracelular, el movimiento de cromosomas, de cilios y de flagelos, son sensibles a
temperatura, presión y drogas como colchicina, vinblastina y taxol.
El movimiento ciliar en las células de las branquias de moluscos bivalvos y en la tráquea de varios
vertebrados forman ondas metacromáticas; su movimiento necesita de ATP que proporciona la
energía cuando la molécula es degradada por ATPasas localizadas en el axonema del cilio.
Materiales y equipo.
Microscopio (40X y 100x) Portaobjetos y cubreobjetos Estuche de disección
Aceite de inmersión Hielo, Caja petri Matraz erlenmeyer
Tapón de hule Tubos de vidrio capilares KCN 00.5M
Humo de cigarro Ostiones con valva recién sacados de su ambiente
Método.
1. Abrir las valvas del ostión
2. Cortar el músculo aductor que une al ostión con su valva derecha.
3. Colocar en la caja petri el organismo sobre su valva izquierda, tratando de no derramar el
líquido que contiene.
4. Depositar el líquido de tres ostiones en un matraz. Preparar la solución de cianuro de K,
burbujear el humo del cigarro.
5. Descubrir el cuerpo del molusco cortando el manto que lo cubre.
6. Tomar cuatro trozos de la región de las branquias, de aproximadamente 5mm y colocarlos,
en las excavaciones y etiquetar los porta A-D.
7. Al portaobjetos A agregarle dos gotas del líquido frío y mantenerlo sobre hielo.
8. Al portaobjetos B agregarle dos gotas de solución de KCN.
9. Al portaobjetos C agregarle dos gotas de solución con humo de cigarro.
10. Al portaobjetos D agregarle dos gotas de solución natural y mantenerlo a temperatura
ambiente.
11. Colocar el cubreobjetos y observar en 40X y en 100X. tomar foto.
Resultados.
- Portaobjetos A: se observó poco movimiento ciliar debido a la temperatura fría en la que se
encontraba la muestra.
- Portaobjetos B: Se observó mucho movimiento acelerado.
- Portaobjetos C: Se observó, al igual que en el portaobjetos B mucho movimiento acelerado
de los cilios, esto debido a que se les agregó cianuro.
- Portaobjetos D: No se observó mucho movimiento. Debido a que esta muestra se dejó en
temperatura ambiente y no se le agregó ningún reactivo el movimiento fue lento y normal.

4. Práctica 16. Separación de cloroplastos: contenido de clorofila.
Objetivo: el alumno aislará cloroplastos y calculará los miligramos de clorofila por gramo de tejido.
Introducción.
El cloroplasto es el sitio de fotosíntesis en algas y plantas superiores; la primera indicación de que
tenía una función fotosintética fue observada en 1882, por Theodor Englemann´s en el alga
Spirogyra. En las células de vegetales hay desde 1 a 1000 cloroplastos, con un tamaño de
aproximadamente 5µ y forma elipsoidal. Presenta una membrana externa y una interna, además de
una tercera que es el tilacoide, organizada en forma de discos, llamadas grana, que se encuentran
interconectados. En el estroma hay una solución de enzimas, ADN, RNA y ribosomas.
Los lípidos de la membrana del tilacoide tienen una composición diferente al resto de los lípidos de
membrana, solo el 10% son fosfolípidos, aproximadamente el 80% no tienen carga y son mono y
digactosil diacilglicerol, un 10% son sulfolípidos (sulfoquinovosil diacilglicerol). La cadena acil de
estos lípidos es insaturada, lo que le da una alta fluidez. El principal fotorreceptor en la fotosíntesis es
la clorofila, con un anillo tetrapirrólico cíclico, un grupo hemo y un ión Mg.
Materiales y Equipo.
Mortero Matraz erlenmeyer Tubos de ensayo para centrifuga
Probeta de 100ml Pipetas de 10 y 0.1 ml Pipetas Pasteur con bulbo
Papel filtro Portaobjetos y cubreobjetos Gasas
NaCl 0.35M Buffer tris 0.2M Acetona a 8%
Agua destilada Hojas frescas de espinacas Microscopio compuesto
Espectofotómetro Centrífuga Hielo
Método.
1. Lave con agua de la llave las hojas de espinaca, séquelas y con una navaja quite el tallo y
las nervaduras.
2. Pese 25g y muela en el mortero con 50ml de NaCl, más de 5ml de buffer Tris. Filtre en capas
de algodón y tome 5ml para centrifugar a 1000 rpm, durante 5 minutos. Hágalo por
duplicado.
3. Transfiera el sobrenadante a otro tubo y centrifugue a 2500 rpm por 10 minutos. Desechar el
sobrenadante, en el precipitado se encuentran los cloroplastos intactos. Resuspéndalos
suavemente con pipeta Pasteur, después de agregar 2-3 ml de NaCl. Tome una gota y
póngala entre porta y cubreobjetos y observe al microscopio a 40X.
4. Al resto agregarles 5ml más de NaCl y vuelva a centrifugar a 2500 rpm por 10 minutos.
Etiquételo como suspensión de cloroplastos
5. Colocar 0.1ml de suspensión de cloroplastos en un tubo de ensayo y agregar 10ml de
acetona a 80%, agitar suavemente y filtrar en papel filtro, recoger el filtrado en un tubo de
espectrofotómetro y leer a 625nm de longitud de onda.
6. Use solución de acetona como blanco. Multiplique el valor de absorbancia por 5.8, para
obtener los miligramos de clorofila por mililitro de suspensión de cloroplastos.

5. Práctica 15 Mitocondria: identificación de Citocromo C y deshidrogenasa succínica
Objetivo: identificar indirectamente la actividad de las enzimas deshidrogenasa succínica y
Citocromo C, marcadores de la mitocondria.
Introducción.
Los marcadores enzimáticos, permiten identificar bioquímicamente a los organelos donde se
localizan la enzima o enzimas. El Citocromo C es una enzima transmembranal que se encuentra en
la membrana interna de la mitocondria y participa en la cadena de electrones, para las reacciones
de oxido reducción, cuyo aceptor final es el oxígeno para darnos agua y ATP. La presencia del
Citocromo C reducido es a través de su espectro de absorber, es decir su capacidad de radiación
electromagnética a 550 nm.
El proceso en general donde las moléculas orgánicas son oxidadas a CO2, se le conoce como
respiración aérobica cuando el aceptor de electrones es el oxígeno. Respiración anaeróbica o
glucólisis, cuando el O2 no participa y generalmente ocurre en el citoplasma.
Otra enzima marcadora de la mitocondria, es la succinato deshidrogenasa que cataliza la
reducción del Citocromo C, cuando el succinato es oxidado a fumarato, requiere FAD que se
reduce a FADH y este facilita la reducción del Citocromo C, permitiendo que este transfiera los
electrones a otros aceptores de la cadena de electrones.
El cianuro de potasio inhibe el último paso de cadena de electrones de esta manera se evita, la
formación de ATP y el flujo de electrones continué, por lo tanto las moléculas de la Citocromo C
quedan en estado reducido, ya que las otras enzimas que consumen al Citocromo C se encuentran
inhibidas por el efecto del cianuro.
Materiales y equipo.
Medio de mantenimiento para mitocondrias: 300 ml (sacarosa 69.8 mM., d-manitol 210.2 mM., Tris
CHl 10 mM. Albumina 0.5% pH 7.4).
Medio para identificar la actividad de la Citocromo C en mitocondrias
50 ml de aislamiento adicionado con MgCl2 2.6 mM 10 ml de succinato de Sodio 1N
10 ml de cianuro Espectrofotómetro
Método.
Numerar 10 tubos o matraces erlenmeyer de 25 ml y preparar los siguientes sistemas de incubación
en cada uno de ellos de acuerdo a la tabla siguiente:
Tubo Succinato de Na Cianuro de Buffer de Homogenado
0.1 ml Potasio 1N Mitocondrias hepático
100µgr/tubo
1 + 0.2 ml 4 ml Fc1
2 + 0 4 ml Fc1
3 + 0.2 ml 4 ml Fc2
4 + 0 4 ml Fc2
5 + 0.2 ml 4 ml Fc3
6 + 0 4 ml Fc3
7 + 0.2 ml 4 ml Fc4
8 + 0 4 ml Fc4
9 + 0.2 ml 4 ml 0

6. Después de leer adicionar 2ml de azul de metileno a cada tubo, distinguir cuales tubos presentan
una mayor coloración.
Los tubos se deben mantener en frío hasta que la reacción se empiece, y se leen a 550 nm, se
incuban a 30° C durante 30 minutos, y se vuelven a leer a 550 nm.