El documento describe dos técnicas de diagnóstico de Ebola: RT-PCR y ELISA. RT-PCR consiste en la amplificación de un segmento específico del ARN del virus mediante la transcripción reversa del ARN a ADN complementario, seguido de la replicación del ADN a través de múltiples ciclos de desnaturalización, alineamiento y elongación. ELISA detecta la presencia de antígenos o anticuerpos mediante la unión enzimática de un complejo anticuerpo-antígeno a una superficie, revelando la reacci

1. Diagnóstico de Ebola
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Camila Sacristán
Universidad de Chile
Departamento de Tecnología Médica
Fotografía Médica

2. RT-PCR
 Generalidades:
- La reacción en cadena de la polimerasa
con transcriptasa reversa, consiste en la
amplificación de un segmento especifico
del ARN del virus con una enzima
polimerasa, previo a la amplificación se
utiliza una enzima llamada transcriptasa
reversa que copia este ARN a un ADN
complementario o copia (ADNc) ya que
la polimerasa solo amplifica ADN.
- La reacción después de la formación del
ADNc consta de tres etapas:
desnaturalización de la hebra, alineación
o hibridación y elongación, las cuales se
repiten aproximadamente 30 veces
dentro de un termociclador
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3. RT-PCR
 Los reactivos necesarios para esta técnica son:
- Primers o partidores, que establecen el marco de la amplificación
- Nucleótidos: Adenina (A), Citocina (C), Guanina (G) y Timina (T), estos son
los componentes básicos de la cadena de ADN
- Inhibidores de la ARNasas, ya que estas enzimas degradan el ARN que se
intenta amplificar
- Enzima polimerasa, que el la que amplifica el ADN
- Buffer o solución tamponada para mantener el pH de la reacción
- Sales de Magnesio, que sirven como cofactor de la polimerasa
- Agua
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4. Técnica RT-PCR
Antes de iniciar la amplificación, la transcriptasa inversa
transcribe el ARN viral extraído de la muestra a ADNc
Primera etapa: Desnaturalización de la hebra
- Durante la desnaturalización, que se realiza por
calentamiento de la mezcla a 95ºC, se separan las dos
cadenas del ADN molde.
Imagen sin licencia comercial, modificada en su tono (-180) y saturación (+100). Imagen original (arriba) e imagen modificada (abajo)
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5. Técnica RT-PCR
Segunda etapa: alineación
-Durante la hibridación, la
temperatura de incubación
se reduce para permitir el
apareamiento de las bases
de ambos cebadores en el
sitio donde encuentran una
secuencia complementaria.
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Imagen sin licencia comercial, modificada en su luminosidad (+66) y saturación (+15).Imagen original (frente) e imagen modificada (fondo)

6. Técnica RT-PCR
Tercera etapa: Elongación
Durante la fase de elongación, la mezcla se calienta
a 72ºC y la enzima ADN polimerasa se usa para
replicar las hebras de DNA.
Al finalizar cada ciclo, la cantidad de ADN molde
disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble
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Imagen sin licencia comercial, modificación de contraste (+100) y aplicación de filtro artístico Bordes añadidos.
Imágenes originales (superiores) y modificadas (inferiores)

7. Técnica ELISA
ELISA: Ensayo por Inmunoabsorción ligado a enzimas
Generalidades:
-Es la reacción de un complejo anticuerpo-enzima con un antígeno o
anticuerpo que está fijado a una superficie solida. Para detectar la
reacción se añade un sustrato a la enzima para que genere un producto
coloreado, lo que indicará la presencia del antígeno o anticuerpo
buscado.
- Hay diferentes tipos de ELISA, como por ejemplo el directo, indirecto, el
tipo sandwich, competitivo, etc
Imagen sin licencia comercial, modificada en sus niveles de color: +45 hacia el rojo y -100 hacia el amarillo. Imagen original (derecha) e imagen modificada (izquierda)

8. Técnica ELISA
ELISA tipo sandwich:
-Se fija un anticuerpo a la
superficie del soporte o pocillo, al
cual se unirá una zona especifica
del antígeno (epítope) que se
sospecha está en la muestra.
-Se agrega la muestra a estudiar
-Lavar para eliminar los
antígenos que no se han unido a
los anticuerpos fijados en el
pocillo.
Imagen sin licencia comercial modificada en su brillo (-66) y contraste (+62). Imagen Original (arriba) e imagen modificada (abajo)

9. Técnica ELISA
- Luego se agrega un anticuerpo ligado a una
enzima que se unirá a otro epítope del mismo
antígeno
- Lavar para eliminar los anticuerpos marcados
que no hayan reaccionado
- Si se produce la unión la enzima estará presente
en el pocillo después de los lavados, y al agregar
el sustrato se formará un producto coloreado.
Imagen sin licencia comercial modificada en su brillo (-66) y contraste (+62). Imagen Original (arriba) e imagen modificada (abajo)

10. Técnica ELISA
Lectura.
-Se puede realizar de forma visual
para saber cualitativamente la
presencia o ausencia del antígeno o
anticuerpo buscado, esto se puede
hacer en los ensayos que no
requieren cuantificacion y no se
presenten abundantes casos
dudosos.
-También se puede realizar con la
ayuda de un lector de ELISA. Los
resultados finales de la lectura
colorimétrica se reflejan
numéricamente mediante valores de
absorbancia o densidad óptica que
se obtendrán a la longitud de onda
más adecuada para la coloración
final alcanzada.
Imagen sin licencia comercial modificada en su tono (-38), saturación (+15) y luminosidad (+12). Imagen original (izquierda) y modificada (derecha)

11. Bibliografía
 http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/Dibulgeneral/PCR/PCR.htm
 http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/dermatologia/v09_sup1/tecnicas_2.h
tm
 FAO: Manual de procedimientos para el diagnostico molecular de la
Influenza aviar de alta patogenicidad, capítulo 3: generalidades de la
técnica RT-PCR.
 Cultek: Fundamentos y tipos de ELISA

12. FIN
FIN