ACTIVACION DE LINFOCITOS CD8 CONTRA ADENOCARCINOMA

1. UN TCR AB AISLADO RESTRINGIDO POR HLA-
A*02:01/CT37
PÉPTIDO QUE REDIRIGE LAS CÉLULAS T CD8+ PARA M
ATAR Y
SECRETAR IFN-
G EN RESPUESTA A LÍNEAS CELULARES DE
ADENOCARCINOMA DE PULMÓN
Alumnos: Johnny Aguilar Montalván
José Marino Gonzales Vásquez

2. El cáncer de pulmón es una de las principales causas d
e muerte relacionada con el
cáncer
entre hombres y mujeres en los Estados Unidos, donde
el
cáncer de pulmón de células no pequeñas representa a
proximadamente el 85% de los cánceres de pulmón.
En este estudio, informamos el aislamiento de as cad
enas de TCR a y b específicas del péptido HLAA*
02:01/CT37 de un clon de
INTRODUCCIÓN

3. La primera opción es
el tratamiento con estos Abs a demostrado que
estos
tumores expresan Ags inmunogénicos . Algunas
de las moléculas inmunogénicas más expresadas
(aberrantemente) en varios tumores, incluido el
adenocarcinoma de pulmón (ADC), son los Ags
cáncer/testículo (CT).
INTRODUCCIÓN

4. Selección del CT Ag
 El estudio seleccionó aquellos Ag CT con proteína expresada solo en
células cancerosas, además seleccionaron aquellos CT Ag que se
expresan en NSCLC (7–11). Un CT Ag ideal tendrá péptidos restringidos
por las moléculas MHC de clase I más frecuentes en varias
poblaciones, incluidas HLA-A*02:01, HLA-A*24. :02.
Pacientes
 Se reclutó un total de 43 pacientes, incluidos 20 pacientes con ADC de
pulmón, en 2010-2012. El resto fue reclutado en 2013.
 Seleccionamos nueve pacientes positivos para HLA-A*02:01, cuyos
tumores expresaban ARNm de CT37. Cuatro estaban dispuestos a
donar leucocitos para el análisis FACS y el aislamiento y clonación de
las cadenas a y b de TCR.

5. Ensayo de PCR en tiempo real
Para la evaluación de la expresión de CT37 (FMR1NB/NY-SAR-35), utilizamos el sistema de
PCR en tiempo real rápido 7500 y cebadores de ensayo bajo demanda para CT37
El ARN total se extrajo de los tejidos tumorales utilizando el RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit
RNA o de las células utilizando el kit de aislamiento de ARN de Qiagen. El ADNc se obtuvo a
partir de 3 mg de ARN total utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta
capacidad
Análisis IHC de tejidos pulmonares
Se utilizaron las muestras de tejido pulmonar de 10 pacientes con ADC pulmonar que se
sometieron a cirugía, se fijaron en paraformaldehído y se incluyeron en parafinas.
Se utilizó la recuperación de epítopos inducida por calor en tampón citrato (Thermo Fisher
Scientific, Waltham, MA), Ab policlonal CT37 antihumano de conejo HPA011284 y un sistema
de detección de polímeros.

6. Aislamiento de células T CD8+ específicas del péptido HLA-A*02:01/CT37
Los leucocitos se obtuvieron del donante NSCLC_7 mediante leucoféresis. La mitad dela
bolsase utilizó para aislar PBMC mediante centrifugación en gradiente de Ficoll. Luego, se
seleccionaron células T CD8+ utilizando el kit de aislamiento de células T CD8+ de Miltenyi
Biotec para aislar células péptido-Ag específicas mediante selección positiva utilizando
pentámeros biotinilados.
Se añadió IL-2 humana recombinante 72 h después de la estimulación con péptidos y los
cultivos se dejaron durante 10 días (para dejar reposar las células). Luego, 48 h después de
la estimulación con IL-2 y cada 48 h posteriormente, se recuperaron100 ml de medio de
cultivo gastado de cada pocillo y se reemplazaron por 100 ml de medio completo nuevo por
pocillo. Después de dos ciclos de estimulación, se recogieron las células; Las células vivas
se obtuvieron mediante centrifugación en gradiente de Ficoll y se analizaron mediante FACS
para control de calidad.
Los cultivos se colocaron en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada a 37ºC y 5%
de CO2
Clonación de células T CD8+ específicas del péptido HLA-A*02:01/CT37
Se clonaron células T CD8+ específicas del péptido HLA-A*02:01/CT37 utilizando la técnica
de dilución limitante.
72 h después de la estimulación con péptidos. Los cultivos se colocaron en una incubadora
de cultivo de tejidos humidificada durante 10 días (para dejar reposar las células), a 37 ° C y

7. Aislamiento y clonación molecular de los ADNc de las cadenas
a y b de TCRespecíficos del péptido CT37
A continuación, se lisaron T CD8+ específicas del péptido utilizando
tampón RLT y se extrajo el ARN total utilizando el kit de aislamiento
de ARN de Qiagen. Se agregaron ARN en inhibidor de RNasa al
ARN total extraído.
El ADNc de la primera cadena se preparó a partir del ARN total
transcrito de forma inversa utilizando el kit SMARTer RACE
Aislamiento de proteínas de la superficie celular y análisis
Western Blot
Las proteínas de la superficie celular de células T CD8+
transducidas con retrovirales estables se biotinilaron y aislaron para

8. Análisis FACS
FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter) es un tipo especializado
de citometría de flujo, que ordena una población de células en
subpoblación utilizando etiquetado fluorescente.
Producción de IFN-g y ensayos ELISPOT de IFN-g
Se realizaron experimentos en frío similares. Los
sobrenadantes se recogieron de cocultivos E:T que se
dejaron durante 4 h y se analizaron para determinar la
secreción de IFN-g utilizando kits ELISA de alta sensibilidad
(Thermo Fisher Scientific)


9. ¿Qué es un INMUNOENSAYO?
 Es una prueba que usan complejos antígeno:anticuerpo
(también denominados inmunocomplejos) para medir la
presencia de un analito¹ específico en una muestra.
“Inmuno” se refiere a una respuesta inmunológica que hace
que el cuerpo genere anticuerpos, y “ensayo” se refiere a una
prueba. Entonces, un inmunoensayo es una prueba que utiliza
inmunocomplejos cuando hay una unión Ag-Ac.
 Los Inmunoensayos se diferencian de otros tipos de pruebas
de laboratorio (como las pruebas colorimétricas) ya que usan
complejos Ac-Ag para generar una señal que pueda medirse.
 Los Acs son la base de los inmunoensayos, ya que poseen
una alta especificada y afinidad para un Ag específico. Es
esta unión lo que permite la detección de analitos por medio
de una variedad de técnicas de inmunoensayo.
¹Analito es
todo lo que se
mide en una
prueba de
laboratorio.
En el
inmunoensayo,
el analito puede
ser tanto un Ac
como un Ag.

10.  El nombre enzyme-liked immunosorbent assay,
luego abreviado como ELISA, fue acuñado por
los investigadores suecos Eva Engvall y Peter
Perimann, los cuales describieron el
procedimiento, publicado en 1971.

11. INTRODUCCIÓN:
 El método ELISA, se basa en el uso de Ags o Acs
marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto
inmunológica como enzimática.
 Al estar uno de los componentes (Ag o Ac) marcado
con una enzima e insolubilizado sobre un soporte o
pocillo (inmunoadsorbente) la reacción Ag-Ac quedará
inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada
mediante la adición de un substrato especifico que al
actuar, la enzima producirá un color observable a
simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotómetro o un colorímetro.

12.  FASE SÓLIDA
 Antígeno o Anticuerpo
 Conjugado: ENZIMA
 SUBSTRATO

13. SE PUEDEN UTILIZAR DOS TIPOS DE
SUSTANCIAS
 Las que favorecen la adsorción física (por fuerzas
electroestáticas) de las moléculas de Ags o Acs:
poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno,
nylon y silicona.
 Las que permiten la fijación covalente de esos
reactivos: acrilamida, celulosa y isoticianato
 Los mejores resultados se obtienen con el
peliestireno y el polvinilo, por su rigidez,
transparencia y propiedades adsortivas.

14. La enzima escogida como marcador debe:
 Unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos,
 Encontrarse en estado puro a un precio razonable y
 Tener un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y
de fácil preparación.
Las enzimas más utilizadas
son fosfatas alcalina,
peroxidasa de rábano y ß-
galactosidas

16. La elección del substrato es de gran importancia
para la estandarización del método ELISA y hay
que tener varios factores en cuenta, como son
sensibilidad, especificidad, facilidad de lectura,
así como estabilidad después de la
reacción.
Requerimientos del sustrato
• Solubles en agua
• Fácil de manipular
• No tóxicos, no mutagénicos
• Bajo costo

17. Materiales Orgánicos
 Las Muestras del Paciente (Saliva, orina, heces, sangre,
etc.)
 Antígenos
 Anticuerpos
 Enzimas
Materiales No Orgánicos
 Microplacas de 96 pocillos de plástico con fondos de
pocillo ópticamente claros, pipeta multicanal, pipeta de
100µ.
 Espectrofotómetros de lectura de placas (lectores
ELISA).

18. TIPOS:
 ELISA no competitivo:
Consiste en enfrentar la muestra con el Ag o Ac que está en la
fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo Ag-Ac,
y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato
desarrollando color.
 Directo: Detectan Ag
 Indirecto: Detectan Ac
 ELISA Sandwich
 Doble (DAS)
 Heterólogo (HADAS)
 ELISA competitivo:
El Ac de la muestra va a competir con el conjugado por un
número limitado de sitios de unión del Ag. Habrá ausencia de color en
una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la

19. Pasos generales…
1. Tapizado del pocillo con el Ag o
Ac.
2. Adición de la muestra problema
con la mezcla de Ags o Acs.
3. Unión del Ag o Ac específico al Ag
o Ac tapizado en el pocillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el
exceso de Ag o Ac no unido.
5. Adición del Ac secundario
marcado con la enzima.
6. Unión del Ac secundario al Ag o
Ac.
7. Lavado del pocillo para eliminar el
exceso de enzima no unida.
8. Adición del sustrato.
9. Unión del sustrato a la enzima.
10. Coloración.
El primero es el
ELISA directo,
seguido del indirecto

20. ELISA directo
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Acs específicos.
2. Lavado con solución salina Tween 20 como agente tensioactivo
(ph-7,2) para eliminar los Acs fijados deficientemente o no fijados.
3. Adición de la muestra problema conteniendo Ags que permitirá la
unión al Ac tapizado en el pocillo.
4. Adición de Acs marcados (“conjugados”) con una enzima; si los
Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedará solubilizado.

21. ELISA directo
5. Adición de un substrato sobre el que sea capaz
de actuar la enzima marcadora.
6. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
Los lectores
ELISA se
llaman
espectrofómet
ros!!

22. ELISA indirecto
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Ags específicos.
2. Lavado con solución salina Tween 20 como agente tensioactivo
(ph-7,2) para eliminar los Ags fijados deficientemente o no fijados.
3. Adición de la muestra problema conteniendo Acs que permitirá la
unión al Ags tapizado en el pocillo.

23. ELISA indirecto
4. Adición de Acs marcados (“conjugados”) con una enzima; si los
Antianticuerpos reaccionan con los Acs, el complejo quedará
solubilizado.
5. Lavado para eliminar los Acs marcados que no hayan
reaccionado.
6. Adición de un substrato sobre el que sea capaz
de actuar la enzima marcadora.
7. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

24. ELISA indirecto
Por si no les ha
quedado claro…

25. Ag o Ac
fijado a
una fase
Sólida
Ag o Ac
en la
Muestra
Conjugado:
Ac unido a
ENZIMA SUSTRATO
CAMBIO
DE
COLOR

27. LECTURA E INTERPRETACIÓN
DE RESULTADOS:
 Una de las grandes ventajas de la técnica
ELISA es la posible automatización de la
lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha
automatización se puede conseguir con un
simple colorímetro o espectrofotómetro de
cubeta o con sofisticados equipos de
lectura automática de microplacas.
 Los resultados finales de la lectura
colorimétrica se reflejan numéricamente
mediante valores de absorbancia o
densidad óptica que se obtendrán a la
longitud de onda más adecuada para la
coloración final alcanzada.

28. APLICACIONES CLÍNICAS:
 Enfermedades producidas por parásitos
 Toxoplasmosis, Triquinosis, Tripanosomas…
 Enfermedades producidas por Micoplasmas
 Enfermedades producidas por bacterias
 Mycobacterium tuberculosis, brucelas, Estreptococos,
Salmonelas…
 Enfermedades producidas por virus
 Enfermedad de Newcastle, Peste porcina, Rotavirus, artritis
vírica, Leucemia felina…
 Otras aplicaciones
 Hormonas (GCH, Progesterona, Testosterona..)
 Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA)
 Inmunopatología (Ac anti-DNA, Factor reumatoide,
Inmunocomplejos circulantes)

29.  En estudios serológicos, hematológicos,
endocrinológicos, oncológicos, en los
transplantes, la medicina forense y la
antropología.
 Con propósitos médicos se han aplicado en
la determinación de hormonas y proteínas
plasmáticas, antígenos tumorales, drogas,
Ag y Ac de microorganismos (parásitos,
hongos, bacterias, virus)
 Los resultados aportan elementos
diagnósticos, información de una
enfermedad y coadyudan en la planificación
del tratamiento