MÉTODOS USADOS EN BIOQUÍMICA.pptx

1. MÉTODOS BIOQUÍMICOS

3. I N T E R A C C I Ó N R A D I A C I Ó N E L E C T R O M A G N É T I C A - M AT E R I A
ESPECTROSCOPIA

5. ESPECTROFOTOMETRÍA
• Método científico utilizado para medir la cantidad de energía radiante
(luz) que absorbe una sustancia química, en función de la longitud de
onda de la radiación; midiendo la intensidad de la luz cuando un haz
luminoso pasa a través de la solución muestra, basándose en la Ley de
Beer-Lambert
Técnica analítica que permite identificar
sustancias y determinar la concentración de
dicho compuesto en solución
Estudia la interacción de la radiación
electromagnética con la materia
La cantidad de luz absorbida depende de
forma lineal de la concentración

6. ESPECTROFOTOMETRÍA
• Determina la concentración de una sustancia, valiéndose de
la capacidad de absorber la luz a determinadas longitudes de
onda.
• Este método emplea una fuente de radiación:
La cantidad de luz
absorbida es
directamente
proporcional a la
concentración de la
sustancia

7. ESPECTRO DE ABSORCIÓN

8. ESPECTROFOTOMETRÍA

9. ESPECTROFOTOMETRÍA
• Fotocolorimetría:
Solo utiliza el espectro de luz visible
Io
It
Lectura de
absorbancia o
densidad óptica
Ley de Bourguer-Lambert-
Beer o ley general de la
espectrofotometría :
permite hallar la concentración
de una especie química a partir
de la medida de la intensidad de
luz absorbida por la muestra.
It/Io = 10
-Abs

10. ESPECTROFOTOMETRÍA
• La relación It / I0 se conoce como transmitancia, T.
• T = It / Io
• Log It/Io=-kLC
• -Log It/Io= kLC
• -Log T= kLC
• -Log T = Absorbancia o densidad óptica.
• Ab= kC L=1 cm

11. ESPECTROFOTOMETRÍA
La solución
estándar, contiene
una concentración
conocida de la
sustancia que se
esta midiendo.
AbX=kCx
Abst=kCst
AbX kCx
Abst kCst
CX = Cst x AbX
Abst
La relación Cst/Abst=
factor de calibración .
CX=Fc x AbX

12. ESPECTROFOTOMETRÍA
• Curva de calibración: también permite calcular la CX.
• Se utiliza cuando son varias soluciones estándar.
• Cuyas concentraciones son conocidas.
• Cuyas absorbancias se miden con el fotocolorímetro o
espectrofotómetro.
Coeficiente de extinción molar= tang. a
a

13. ESPECTROFOTOMETRÍA
• Utilidad:
Concentracion
de las
sustancias.
Identificar una
sustancia.
https://www.youtube.com/watch?v=fXjP10s
dmQU

14. S I G N I F I C A M O V E R C O N E L E C T R I C I D A D
ELECTROFORESIS

15. ELECTROFORESIS
• Transporte de partículas que poseen carga eléctrica a
través de un disolvente mediante un campo eléctrico.

16. ELECTROFORESIS
• Utilidad: caracterizar una macromolécula mediante la
determinación de la velocidad con que se mueve en el
campo eléctrico.
Calcular el peso molecular de una proteína
Distinguir moléculas por su carga neta o su forma
Detectar cambios en aa, de restos polares o no polares.
Para separar cuantitativamente distintas especies
moleculares.

17. Componentes:
• Fuente de
alimentación
• Dos electrodos:
• Ánodo (+)
• Cátodo (-)
• Tampón de
electroforesis
• Soporte
electroforético
ELECTROFORESI
S

18. ELECTROFORESIS
Inversamente
proporcional al tamaño
de la molécula.
Inversamente proporcional a la
viscosidad del medio.
Proporcional a la fuerza
aplicada al campo.
Proporcional a la
carga neta de la
molécula
Inversamente proporcional al
coeficiente de fricción
La velocidad de migración es:

19. ELECTROFORESIS
PARÁMETROS QUE INFLUYEN EN LA MOVILIDAD
ELECTROFORÉTICA:
• Parámetros externos
• Campo eléctrico
• Temperatura
• Parámetros relacionados con el solvente y con el sistema
electroforético
• Viscosidad
• Fuerza iónica
• La naturaleza de los iones componentes
• El pH
• Parámetros relacionados con el soluto
• La carga
• La forma y

20. TIPOS DE ELECTROFORESIS
• Las macromoléculas
están dispersas en
toda la disolución y se
mueven en forma libre
en el medio.
De frente
móvil
• La disolución a tratar se
aplica como una
mancha, o banda, y
las partículas migran a
través de un disolvente,
utilizando un medio
soporte (papel o
ciertos tipos de geles)
Zonal
• La muestra se aplica
también en una zona
pero se añade
continuamente a lo
largo del proceso
Continua

21. ELECTROFORESIS DE FRENTE MÓVIL
• Las sustancias a separar se
introducen en un tubo en forma
de U, disueltas en un tampón de
pH y fuerza iónica adecuados.
• Se colocan los electrodos en
sumergidos en cada brazo del
dispositivo, entre los que se crea
un campo eléctrico, provocando
que las moléculas (proteínas)
cargadas migren hacia los
electrodos de polaridad opuesta.
• Su posición se determina en
función del tiempo por óptica de
Schlieren.
Determinación
de la movilidad y
punto
isoeléctrico de
las proteínas.
Poca utilidad de
la determinación
cuantitativa.

22. ELECTROFORESIS ZONAL
• Se coloca una mancha o fina capa de muestra en
contacto con un medio semisólido o gelatinoso, se aplica
un campo eléctrico y las partículas migran a través del
soporte.
Se utilizan pequeñas
cantidades de muestra.
Soporte: evita las
perturbaciones
mecánicas y las
corrientes de
convección por cambios
de T° o por la densidad
de la disolución.
El medio de soporte
absorbe algunas veces,
varias de las especies
moleculares.
Actúa como tamiz
molecular,
contribuyendo también
a la separación.

23. ELECTROFORESIS ZONAL
• En papel:
20 V/cm.
Utilidad: para el
análisis de
mezclas
proteicas.
200 V/cm, la
velocidad de
separación
aumenta.
Utilidad: para la
separación de
aa y péptidos.
BAJO
VOLTAJE
ALTO
VOLTAJE
Desventajas:
 Si el papel es fino, se puede
desgarrar con facilidad.
 Si el papel es grueso, las
bandas se distorsionan.
 Se produce interacción entre
las proteínas y los grupos
hidroxilos de la celulosa del
papel, por lo tanto la
migración se frena.
 Calidad del papel: 90% de
celulosa absorción de agua y
conductividad eléctrica.
 Efecto electro osmótico
ánodo-cátodo

24. ELECTROFORESIS ZONAL
• En tiras de acetato de celulosa: La mayor parte de
los grupos hidroxilo
de la celulosa están
esterificados con
residuos acetato
No hay
interacción
con las
proteínas.

25. ELECTROFORESIS ZONAL
• En gel:
 Útil para proteínas y pequeñas
moléculas de RNA.
 Mejor efecto como tamiz molecular.
 Proporciona control del tamaño de
sus poros utilizando
concentraciones distintas de
monómeros
 Presenta adsorción despreciable de
proteínas.
 De alta resolución.
 Sus componentes son tóxicos
 Técnica barata,
fácil y rápida
 Buena resolución.
 Separación de moléculas
grandes con r>5-10 nm
(virus. Ac. Nucleicos.
Lipoproteínas.
Almidón
Poliacrilamida
Agarosa
Polímeros de red
tridimensional

26. ELECTROFORESIS ZONAL
• En gel:
• Electroforesis en geles con SDS
• Los pesos moleculares de la mayoría de las proteínas pueden ser
determinados midiendo la movilidad en geles de poliacrilamida con el
detergente dodecilsulfato sódico (SDS).
• Las proteínas multicatenarias se unen al SDS y se disocian, por lo
que se pierde su estructura secundaria.

28. ELECTROFORESIS
• Aplicación:
https://www.youtube.com/watch?v=NL1us
Cc0n38

31. S E PA R A C I Ó N D E L O S C O M P O N E N T E S D E U N A M E Z C L A D E B I D O A L A
I N F L U E N C I A D E D O S E F E C T O S C O N T R A P U E S T O S
CROMATOGRAFÍA

32. CROMATOGRAFÍA
Retención. Efecto
producido sobre los
componentes de la mezcla
por una fase
estacionaria, que puede
ser un sólido o un líquido
anclado a un soporte
sólido
Desplazamiento. Efecto
ejercido sobre los
componentes de la mezcla
por una fase móvil, que
puede ser un líquido o un
gas.

33. CROMATOGRAFÍA
Según la naturaleza de la
fase estacionaria y de la
fase móvil
• C. sólido-líquido. La fase
estacionaria es un sólido y la móvil
un líquido.
• C. líquido-líquido. La fase
estacionaria es un líquido anclado
a un soporte sólido.
• C. líquido-gas. La fase estacionaria
es un líquido no volátil impregnado
en un sólido y la fase móvil es un
gas.
• C. sólido-gas. La fase estacionaria
es un sólido y la móvil un gas.
Según la interacción entre la
mezcla, la fase móvil y
estacionaria
• Cromatografía de
adsorción.
• Cromatografía de
partición.
• Cromatografía de
intercambio iónico.

35. CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
La fase estacionaria es un
sólido polar capaz de
adsorber a los
componentes de la mezcla
mediante interacciones de
tipo polar.
Separación por
adsorción/desorción
cromatografía de adsorción o
cromatografía líquido-sólido,
cromatografía gas-sólido
característica particular : es su capacidad
para diferenciar compuestos isómeros de
mezclas

37. Fase estacionaria Sustancias que separan
Alúmina Moléculas orgánicas
pequeñas, proteínas
Gel de sílice Esteroles, aa, lípidos
Carbón activado Péptidos, aa, azucares
Fosfato de calcio Proteínas, poli nucleótidos
Hidroxiapatita Ácidos nucleicos

38. CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN
La separación se dá
por la partición del
soluto entre dos
fases líquidas
(solubilidad relativa)

39. CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
Fase estacionaria: papel
Identificación de sustancias:
Relación de frente ( Rf)
=Rf = sustancia
Rf distancia recorrida por la sustancia
distancia recorrida por el solvente
ascendente
descendente

40. https://www.youtube.com/watch?v=ZSgR4
WABMIA

41. CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN
• Fase estacionaria: lamina de 0,25 a 0.5 mm sobre una
placa de vidrio o plástico
• Gel de sílice
• Oxido de aluminio
• Silicato de magnesio
• Celulosa
• Poliamida
• Polietileno en polvo
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
 Mayor poder de
resolución
 Mayor velocidad de
separación
 Fácil aislamiento de la
sustancia
Utilidad:
 Identificar sustancias de
bajo peso molecular (aa,
azucares, péptidos,
nucleótidos, lípidos)

42. CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN
• Fase estacionaria: liquida
• Fase móvil: gaseosa (helio, argón, nitrógeno)
• Las sustancias a analizar deben volatizarse.
CROMATOGRAFÍA DE GASES
Utilidad:
 Identifica alcoholes,
esteres, ac. Grasos,
aminas.
 Muy sensible (10
gramos
 Muy rápida
-12

43. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
La fase estacionaria
(cambiadores de iones)
tiene una superficie
cargada iónicamente, con
cargas iónicas opuestas a
las de los eluyentes
 fase sólida: contiene grupos
sulfónicos o carboxílicos (para la
separación de cationes) o grupos
amino cuaternarios, ternarios o
secundarios (para la separación
de aniones)
 fase móvil: los iones (NaHCO3
y Na2CO3)

44. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
• Elección del intercambiador iónico:
• Aniónico o catiónico.
• Elección de la porosidad y tamaño de la matriz:
• Las moléculas pequeñas se separan mejor con tamaño de poro
pequeño.
• Las macromoléculas necesitan tamaño de poro mayor.
• Elección del pH, tampón y condiciones iónicas:
• Tampón catiónico para intercambiador aniónico
• Tampón aniónico para intercambiador catiónico
Intercambiadores iónicos:
Dextrano, celulosa,
estireno-divinil-benceno,
acrílica, fenólica, epoxi
amínica

45. CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN
GEL (EXCLUSION MOLECULAR)
La separación se basa
en el tamaño molecular.
La fase estacionaria es
un material de tamaño
de poro definido
Geles:
 Sophadex: polímero de
dextrano
 Agaraso: polímero lineal
de galactosa
 Poliacrilamida
Utilidad:
Separación de
moléculas que se
diferencian en su
PESO MOLECULAR.
Capacidad del soluto de penetrar en los poros de
la fase estacionaria, las moléculas con menor
tamaño atraviesan la columna sin ser retenidos.
Los solutos demasiado grandes tampoco resultan
retenidos

46. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Condiciones:
 La matriz no debe adsorber por si misma
moléculas.
 El ligando debe unirse a la matriz sin
alteración de sus propiedades .
 Debe escogerse un ligando cuya unión
sea fuerte.
 Debe ser posible la elución sin
destrucción de la muestra.

47. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
• Utilidad: Purificación de
enzimas
Purificación de
anticuerpos
Purificación de
proteínas de
transporte
Purificación de
membranas
Purificación de
glicoproteínas
Separación de células
animales específicas

48. RADIOISÓTOPOS

49. RADIOISÓTOPOS
Becquerel
Descubrió accidentalmente la
existencia de unos rayos
desconocidos que provenían
de una sal de uranio
Pierre y
Madame
Curie
Identificaron que el Polonio
y Radio también emitían
radiación espontanea.
Acuñan termino:
RADIOACTIVIDAD
Irene
Curie y
Frederic
Joliot
Descubrieron la
radioactividad ARTIFICIAL

50. RADIOISÓTOPOS

51. RADIOISÓTOPOS
• Emiten tres tipos de radiación:
Radiación Alfa
• Carga +
• 2 protones y 2
neutrones
• velocidad: 10 -9 cm /seg
• Escasa penetración
• Mayor ionización
Radiación Beta
• Electrones con carga -
(negatrones) o con
carga + (positrones
• Un neutrón se
transforma en un protón
, electrón y un neutrino
Radiación Gamma
• Es de naturaleza
electromagnética
• Disminuye su energía
por emisión de fotones
• Mayor penetración
• Menor ionización

52. DESINTEGRACIÓN RADIOACTIVA
• Incluye la emisión de una partícula beta o alfa del núcleo
del átomo que se desintegra
• La desintegración es proporcional al n° de átomos
radioactivos presentes (cinética de primer orden)
Ley de desintegración radioactiva:
N= No. e
2.3 Log No/N = kt
No: n° de átomos radioactivos en tiempo cero
N: n° de átomos radioactivos que quedan en el tiempo t
K: constante de decaimiento que es propia de cada elemento.
-kt
La unidad básica de
desintegración radioactiva es
el Curie (Ci)
1 Ci = 3.7 x 10 dps
1 Ci = 2.22 x 10 dpm
10
12

53. RADIOISÓTOPOS
TRAZADORES:
Para marcar compuestos químicos e introducirlos en
organismos vivos y determinar sus transformaciones
químicas, para dilucidar vías metabólicas
AUTORRADIOGRAFÍA:
Se marca una biomolécula con un precursor
isotópico y luego se detecta la imagen por
emulsión fotográfica
RADIOINMUNOENSAYO O
RADIOINMUNOANALISIS:
Cuantificación de sustancias en muy bajas
concentraciones mediante la unión de sustancias
radioactivas a anticuerpos
Utilidad:

54. FUNDAMENTO
Se mezcla una cantidad constante de antígeno marcado
radioactivamente y una cantidad constante de un anticuerpo
para ese antígeno
Se produce la reacción entre antígeno (Ag) y anticuerpo (Ac)
Se separa la fracción de antígeno que se ha unido de la que
permanece libre (hay varias formas de hacerlo. En la figura
inferior se utiliza un 2º anticuerpo dirigido contra el primero)
se determina la radioactividad
Si la muestra contiene además antígeno frío (no marcado), éste
competirá con el marcado para unirse al anticuerpo, y se
observará un descenso en la medida de la radioactividad
Este descenso es proporcional a la concentración de antígeno
frío en la muestra
RADIOINMUNOENSAYO: RIA

55. Esta técnica fué desarrollada por Solomon A. Berson y Rosalyn Yalow
en 1960 para determinar la concentración de insulina en el plasma
sanguíneo. Por ese motivo, R. Yalow recibió el Nobel de Medicina en
1977 (Berson murió en 1972). Hoy en día, esta técnica se utiliza para
detectar y cuantificar sustancias que se encuentran en cantidades
muy pequeñas y mezcladas con muchas otras. Es por tanto una
técnica muy sensible y muy específica. Utilizando anticuerpos de
gran afinidad se pueden detectar hasta picogramos de antígeno. (1
pg = 10-12 g).
https://www.youtube.com/watch?v=7bBq1l
O8lIE

56. Antígeno marcado
radioactivamente
Añadido del
primer
anticuerpo
específico
Añadido del
segundo
anticuerpo
Todo el complejo
antígeno anticuerpo
resultará radioactivo
SISTEMA
CONTROL
RADIOINMUNOENSAYO: Solomon A. Berson y Rosalyn
Yalow: 1960
En ausencia de antígeno frío (no radioactivo), todos los
complejos Ag-Ac serán radioactivos. La radioactividad medida
es máxima

57. Antígeno marcado
radioactivamente
MUESTRA
Antígeno no
marcado “frio”
Añadido del
primer
anticuerpo
específico
Añadido del
segundo
anticuerpo
Sólo la mitad del
complejo antígeno
anticuerpo resultará
radioactivo
Se establece una
competencia entre el
antígeno radioactiva
y el antígeno frio
En presencia de antígeno frío (no radioactivo), éste compite con el
antígeno radioactivo para unirse al anticuerpo. Por tanto la
radioactividad medida es menor. El descenso es proporcional a la
concentración de Ag frío presente en la muestra

58. Se construye una curva de calibrado (color rojo) que relacione la medida de
radioactividad (cpm) con la concentración de antígeno frío en la muestra
Si se realiza el ensayo con una muestra que contiene una cantidad desconocida del
antígeno no marcado y se mide la radioactividad asociada a los anticuerpos, por
interpolación sobre la curva de calibrado se puede estimar la concentración del
antígeno frío en la muestra.
Construcción de la curva de calibración
Concentración de antígeno (nM)
Radioactividad
Ag-Ac
(CPM)
CPM del sistema con la
muestra
Cantidad de antígeno
en la muestra
Hormonas:
Prolactina, Glucagon , Insulina, Gonadotrofina Coriónica humana, Corticotropina,
TSH, etc
Otras sustancias:
Morfina , vitaminas, Barbitúricos, Prostaglandinas, cAMP, , Antígenos virales ,
marcadores tumorales, etc.