MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLOGIA

1. I. INTRODUCCION:
En el presente informe en base a lo que se vio en la clase de práctica existen
una serie de factores que influyen en el diseño de un medio de cultivo tales
como los nutrientes que se emplean, las condiciones físicas favorecedoras
para el crecimiento bacteriano, factores como el aporte de nutrientes
determinado por la preferencia de un producto en concreto y las exigencias
nutricionales del microorganismo, toda consideración sobre su pH por su
posibilidad de inhibición del crecimiento microbiano y las necesidades de
gases, al verse afectado por el oxígeno y el dióxido de carbono en el
desarrollo microbiano.
Así también por su tolerancia al oxigeno tenemos que pueden ser aerobias o
bacterias cuyo crecimiento y desarrollo se realiza en presencia de oxígeno
libre, anaerobias o bacterias que crecen y se desarrollan en ausencia de
oxígeno libre, anaerobias facultativas o bacterias que crecen y se desarrollan
tanto en presencia como en ausencia de oxígeno libre, microaerófilas o
bacterias que crecen y se desarrollan en presencia de pequeñas cantidades
de oxígeno libre.
Atendiendo a su influencia lumínica, es importante el suministro de luz para
los organismos fotosintéticos. Esta iluminación no debe causar diferenciación
en la temperatura del medio, recomendándose para ello el uso de lámparas
fluorescentes. En cuanto al control de la temperatura y observación del
proceso metabólico y de la morfología celular, cada especie microbiana tiene
una temperatura ideal de crecimiento.
II. JUSTIFICACIÓN:
Debido a que todos los organismos vivos necesitan un medio o espacio
donde desarrollarse es que es muy importante el conocer los medios de
cultivos para así "cultivar" en el laboratorio microorganismos, suministrándole
los requerimientos que pueden ser de diferente composición dependiendo de
la necesidad del organismo de interés.

2. III. OBJETIVOS:
 Reconocer los diferentes medios de cultivo.
 Conocer cómo preparar y diferenciar los medios de cultivo.
 Conocer las técnicas de esterilización de los medios de cultivo.
 Reconocer los diferentes métodos de siembra y aislamiento.
IV. MATERIALES Y METODOS:
 Materiales:
 lapicero
 libreta de apuntes
 Metodología:
 Practica guiada por el docente
V. RESULTADOS:
EVOLUCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo
Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos
realizados a base de gelatina.
Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor
tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método
enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido.
Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de
patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de
carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina,
logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la
morfología macroscópica de las colonias microbianas.
En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología
en relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse
introduce el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como
solidifícante.

3. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de
cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a
las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta
entonces.
Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones
sobre las bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre
todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de
enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial
composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de
microorganismos que, en función de sus procesos metabólicos, eran los
únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.
En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando
indicadores de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía
observar la producción de ácidos en la fermentación en ciertos
microorganismos.
Un medio de cultivo es una mezcla de diversos nutrientes que en
concentraciones adecuadas permite el crecimiento de microorganismos, bajo
determinadas condiciones físico-químicas. La composición química de los
medios de cultivo es variada pero, de manera general, todos ellos contienen
una fuente de energía (compuesto orgánico o inorgánico), una fuente
carbonada (algunas veces un mismo compuesto puede servir de fuente de
energía y fuente carbonada), sales minerales, vitaminas y agua.
LOS MEDIOS DE CULTIVO EN MICROBIOLOGIA
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de
Microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado

4. de humedad y presión de oxígenos adecuados, así como un grado correcto
de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y
factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos
similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por
eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de
carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.
El agar es un elemento solidifícante muy empleado para la preparación de
medios de cultivo. Se licua completamente a la temperatura del agua
hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones
no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por
aquellas que crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidifícante pero se emplea mucho menos ya
que bastantes bacterias provocan su licuación.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc.
Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de
fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y
la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los
microorganismos menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar,
por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de
unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es
rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa
como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias
Gram-positivas).
CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE
MICROORGANISMOS

5. El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve
afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos
casos, son ajenos por completo al propio medio.
1- disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de
contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales
inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras
sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las
sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones
para las reacciones químicas que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de
infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin
embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios
de cultivo provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles.
Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los
medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente
asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos,
que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad
de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno
presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se
añade a muchos los medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico,
etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales
minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y
sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza
vitamínica.
Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como
indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades
de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
2- consistencia adecuada del medio

6. Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo
productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios
en estado semisólido o sólido.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que
muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas
inferiores al punto de fusión de este solidifícante y de que otros tienen la
capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y
comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está
ampliamente extendido en el laboratorio.
3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de
oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de
variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se
desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En
un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en
condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy
reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz
de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxígeno y
el dióxido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y
variable al oxígeno libre clasificándose en cuatro grupos:
I.-Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre.
II.-Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre.
III.-Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia
como en ausencia de oxígeno libre.
IV.-Microaerófilas: bacterias que crecen en presencia de pequeñas
cantidades de oxígeno libre.
Para desarrollar bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en
agitación constante o introduciendo aire estéril en el medio.

7. Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar
la exposición de estos microorganismos al O2. Se puede obtener un
ambiente de anaerobiosis por los siguientes métodos:
A.- Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el
tioglicolato sódico, para disminuir el contenido de O2.
B.- Quitando el O2 por procedimientos mecánicos y reemplazándolo por N2
CO2.
C.- Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio
de cultivo inoculado para combinar el oxígeno libre con otro compuesto. Por
ejemplo: al encender una vela se transforma el oxígeno en dióxido de
carbono.
4- condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas
microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas
condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una
fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el
crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.
5- Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que
en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de
los microorganismos fotosintéticos.
6- pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento
de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios
con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos.
No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no
impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso
alterar sus procesos metabólicos normales.

8. 7- Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre
15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o
incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los
patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos,
alrededor de 37ºC, y los saprofitos tienen rangos más amplios.
8- Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar
la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso
impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes
inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios
de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente
esterilizante)
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Simples:
Están formados solamente por compuestos químicos simples de fórmula
química bien conocida.
Complejos:
Están formados por líquidos animales, jugos vegetales, extractos de carne,
etc.
También podemos clasificarlos en: electivos, selectivos, diferenciales y
enriquecidos.
Medios selectivos:
Otro importante método de separación de cultivos mixtos, es por medio del
uso de un medio selectivo. Este es un medio que ha sido modificado para
incluir uno o más agentes inhibitorios. La elección de un medio selectivo debe
ser apropiada para el aislamiento del organismo que interesa. Las sustancias

9. inhibitorias pueden ser colorantes, antibióticos, sales biliares y sustancias
que afecten el metabolismo enzimático de algunas especies. Los medios
selectivos para especies Gram- , pueden incluir cristal violeta el cual inhibe
el crecimiento de muchas bacterias Gram+. La penicilina con una
concentración de 5,50 unidades/ml inhibe la mayoría de las bacterias Gram+
y por lo tanto el medio se hace selectivo para bacterias Gram-negativas
Los medios selectivos para bacterias Gram-positiva, incluyen Telurito de
Potasio, azida sódica, etc. que inhiben el crecimiento de bacterias Gram-.
Medios diferenciales:
Es aquel que tiene adicionado un reactivo que luego de la inoculación e
incubación nos permite observar diferencias entre los distintos tipos de
microorganismos que se han desarrollado.
Ej.: que tenga agregado un indicador de pH que haga variar el color del medio
cuando se encuentre frente a un microorganismo.
Medios enriquecidos:
Cuando se agrega una sustancia para enriquecerlo, aportando algún factor
de crecimiento necesario para el microorganismo que el medio no lo posea.
Cuando se necesita obtener un cultivo de un organismo determinado es
necesaria una técnica de enriquecimiento adecuada para esa especie. Los
métodos se basan en cualquier característica fisiológica del organismo
deseado, por ejemplo, pH o temperatura óptima, requerimientos nutricionales
o tolerancia a algunos inhibidores.
En algunos casos se puede hacer un tratamiento térmico de suspensiones
de suelo para el aislamiento de organismos esporulados y otros organismos
termo-resistentes, seguidos por un plaqueo en medio sólido. Otras veces se
puede usar diferentes temperaturas de incubación, de manera que el
organismo deseado aumente su número en relación con el de los otros

10. organismos presentes. El procedimiento de enriquecimiento en medio líquido
es inadecuado para dar un cultivo puro, y el procedimiento final de
aislamiento, comprende la obtención de colonias separadas en medio sólido.
COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Peptonas
Las características de una peptona dependen de la pureza y calidad del
material proteico empleado y del método de hidrólisis.
La hidrólisis ácida y alcalina tienden a destruir el contenido de vitaminas de
la proteína, y parte del contenido de aminoácidos también pueden perderse.
La hidrólisis enzimática tiende a preservar las vitaminas y a mantener intacto
el contenido de aminoácidos. Por Ej., la caseína pura no contiene hidratos de
carbono y tiene gran contenido de triptófano y vitaminas. Una peptona de
caseína preparada por hidrólisis ácida no tiene triptófano ni carbohidratos y
puede usarse como ingrediente en medios para analizar el contenido
vitamínico de sueros o de preparaciones farmacéuticas.
Casi todos los extractos de levadura microbiológicos son en realidad peptona
de levadura, debiéndose la digestión de las células de levaduras a sus
propias enzimas autolíticas.
Infusiones y extractos
Las infusiones y los extractos de carne y otros tejidos se usaron antes de
conocerse las peptonas, hoy se los sigue usando en menor medida.
La excesiva contaminación microbiana de peptona, infusiones y extractos u
otros ingredientes los hace poco seguros para propósitos científicos, aunque
generalmente favorecen el crecimiento de otros microorganismos. Si se
preparan estos materiales en un laboratorio siempre deben hacerse las

11. pruebas de contaminación antes de usarlos. Esto se hace de la siguiente
manera:
Disolver 1gr. del material a examinar en 10,0 ml de agua purificada. Extender
0,01 ml sobre un área de 1 cm2 de una lámina portaobjetos de vidrio, secada
al aire, y colorear por el método de Gram.
Examinar 10 campos con una lente de inmersión en aceite. No debe haber
más de 50 microorganismos o grupos visibles en 10 campos.
Los medios pueden ser: líquidos o agarizados.
Agentes solidificantes
El agar es un polímero de la galactosa que es esterificado con ácido sulfúrico
y se extrae de ciertas algas marinas rojas, las Rhodophyceae, debe estar
limpio y libre de desechos. Se agrega a la solución acuosa del 1,5 al 2%.
El medio agarizado comienza a fundir a los 100°C, si bien se mantiene líquido
hasta los 45°C, en donde se comienza a solidificar.
Indicadores colorimétricos
Los indicadores pueden incluirse entre los medios. Los indicadores de pH
más usados son rojo fenol, azul bromotimol, púrpura de bromocresol y rojo
neutro. Estos indicadores se usan para demostrar la producción de ácido por
un hidrato de carbono contenido en el medio.
El azul de metileno y la resazurina son los indicadores de Eh (carga iónica)
más usados actualmente.
Algunos lotes de pH y Eh pueden ser tóxicos para algunos microorganismos
y deben probarse antes de usarlos.

12. Agentes selectivos
Agentes selectivos que permiten el crecimiento de algunos microorganismos
e inhiben el de otros pueden incorporarse a los medios. Son muy útiles para
los trabajos de identificación. Se han ensayados muchos agentes selectivos
y algunos son muy valiosos y usados. Los colorantes fueron probablemente
los primeros agentes selectivos que se emplearon. Son ejemplos el cristal
violeta y el verde brillante, que se usan para inhibir microorganismos Gram-
. El cloruro de sodio en altas concentraciones inhibe el crecimiento de casi
todas las bacterias, pero es bien tolerado por los estafilococos. La azida de
sodio, el citrato y el telurito de sodio, el laurisulfato y el selenito de sodio, el
iodo y el feniletanol se usan para dar selectividad.
Un medio puede hacerse selectivo ajustando la reacción a un pH muy alto o
muy bajo para permitir el crecimiento de algunos microorganismos e inhibir
el de otros. Un ejemplo bien conocido es el uso de un pH 5,6 en medio de
Sabouraud para el crecimiento de levaduras y mohos.
Agentes reductores
Agentes reductores puede agregarse para promover la anaerobiosis. Uno o
más compuestos como los siguientes pueden usarse: ácido ascórbico,
tiogilcolato de sodio, formaldehído sulfoxilato de sodio, ácido tiomálico,
hidrosulfito de sodio y cisteína. Muchos medios que no contienen agentes
reductores y se usan normalmente para cultivar aerobios pueden emplearse
para cultivar microorganismos de requerimientos especiales incubándolos en
propano, hidrógeno, metano u otros gases.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
La preparación de medios terminados a partir de materiales deshidratados
debe hacerse de acuerdo a las instrucciones. Sólo debe usarse equipos y
cristalería química limpios. El agua debe ser siempre destilada o

13. desmineralizada, salvo indicación en contra. La pesada exacta de los
materiales y la medida correcta de agua son esenciales. El calor debe ser
directo o en baño de agua hirviendo o recipientes envueltos en vapor con
agitación. El calentamiento excesivo debe evitarse. La homogeneidad
también es esencial, especialmente para medios que contienen agentes
gelificantes. El mezclado debe ser suave para lograr homogeneidad sin
espuma ni burbujas.
La esterilidad se hace de varias formas, generalmente por autoclave o
filtración. Casi todos los medios se esterilizan a 121°C durante 15 minutos
para volúmenes de hasta 500 ml. Para volúmenes mayores el tiempo debe
extenderse a 20, 30 ó más minutos según sea necesario.
Para verificar la esterilización placas y tubos con el medio se deben incubar
a 20-25°C ó 30-35°C durante varios días o semanas. Los medios deben
guardarse en un refrigerador.
MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO
Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste
en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un
medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar
este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo,
existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar
precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en
estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino
también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el
medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la
incubación condiciones tales como la temperatura, aireación, la luminosidad.
La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los
microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención

14. de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización,
aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos
depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio.
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo
de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La
población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina
cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se
denomina cultivo puro o axénico, cuando contiene más de una especie de
microorganismos se denomina cultivo mixto.
.Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es
conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Un
cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una
sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los
medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-
existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes
especies de forma conjunta.
Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de
obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que
los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el
laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos.
Estos microorganismos no deseados contaminantes deben ser eliminados
de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener
un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un
microorganismo en un medio sólido o líquido, esterilizado previamente. De
esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá
multiplicar en condiciones favorables. Un clon está constituido por una
población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia
es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie
de un medio sólido. Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto
tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo

15. nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar.
En esta transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes
a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y
concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas:
Los utensilios utilizados para la transferencia de muestras son los siguientes:
Hisopo, pipeta (para uso microbiológico son terminales y la parte superior o
boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta Pasteur, hazas de
siembra dispuestas en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho.
En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de
inoculación, hisopos, pipetas o pipetas Pasteur que deberán esterilizarse
previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los diferentes
medios de cultivo tiene aplicaciones específicas. Por ejemplo en:
Los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con
tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser
transferido mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta
Pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo
de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se
manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas
que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos
acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en
este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y es fácil
homogenizarlas, lo que permite estandarizar la concentración del inóculo. La
desventaja que presentan, es que en ellos e difícil detectar contaminación a
simple vista.
Los medios semisólidos se preparan en tubos, se inoculan con aguja de
siembra (asa recta) o pipeta Pasteur; en este último caso es necesario
calentar el medio y cuando se encuentra en estado líquido y a una

16. temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el inóculo, se homogeniza
y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de
los microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con
diferentes requerimientos de oxígeno.
Los medios sólidos se preparan en tubos o matraces dependiendo de la
cantidad o de las necesidades, después de esterilizarlos, estos se inclinan o
vierten en cajas de Petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la
superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los
microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a
simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan
características que varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio
de cultivo empleado. En cualquier medio de cultivo es de primordial
importancia ajustar el pH, ya que aun cuando la mayoría de los
microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH
alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el
crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este
mismo propósito durante la incubación se deben proporcionar las
condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento
óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría
de las veces están relacionadas con la de su hábitat natural. Algunos
microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas
más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener
estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiológica o un baño
de agua a temperatura constante, en tanto que para los microorganismos
que presentan su crecimiento óptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se
pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperatura ambiente.
En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en
cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La
desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco, lo que
determina la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el

17. crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora
no debe prolongare por más de nueve días.
Con relación a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo
crecen en presencia de oxígeno atmosférico; los que sólo crecen en
presencia de aíre se llaman aerobios obligados; los que sólo crecen en
ausencia de oxígeno se denominan anaerobios obligados o estrictos, un
tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conoce como
facultativos. Existe una cuarta categoría que comprende bacterias que
requieren oxígeno, pero sólo lo utilizan cuando éste existe en
concentraciones reducidas; a estos se les llama microaerofílicos.
El desarrollo de estos diferentes grupos se favorece mediante la agitación de
los cultivos o mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean
sustancias reductoras o equipos especiales. Las bacterias son organismos
procarióticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza,
habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y
animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis
con otros organismos, ya sea como parásitos, comensales o mutualistas.
Fisiológicamente este grupo presenta características muy variables, hay
bacterias móviles e inmóviles fotosintéticas y quimiotróficas, autótrofas y
heterótrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y
condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los
criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología
celular, forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de
esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características
culturales en medios líquidos y sólidos en los que presentan patrones de
desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.
Técnicas de siembra
Método de siembra por estría en placa

18. Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para
ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a
continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido
preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina
simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el
asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos
microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región
donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la
misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este
proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación,
las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células
aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar
colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon
derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células
quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta.
Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico,
conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la
primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi
con toda seguridad, cultivos axénicos.
Métodos de vertido en placa y extensión en placa
En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes
de su siembra en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene
tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola
etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro
debe ser diluida 10
Veces para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro,
Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de
diez en diez, pero a veces de cien en cien.

19. Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión
bacteriana a 9 ml (de medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se
agita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas
veces sea necesario. A continuación, se puede proceder de dos maneras
diferentes.
En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar
fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el
agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se
extenderán y serán más grandes.
En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se
siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas
con ayuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe
en el agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas
técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el
método de siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que
aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado
sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta
que se repita el proceso. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan
la ventaja de que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas
que el método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de
seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de
microorganismos. Para obtener un cultivo axénico mediante este método:
 Hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener
una muestra con sólo unos pocos cientos de bacterias-
 verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter
el contenido en una placa Petri.
 Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más
pequeñas) y en su superficie (más grandes).

20. Método de aislamiento por siembra por estría en placa: Para obtener un
cultivo axénico:
 esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero.
 introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra.
 sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en
una placa Petri, y
 volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y
hacer un segundo grupo de estrías en una región nueva de la placa.
Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que
los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas.
 Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar
seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello
tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa.

21. EL CRECIMIENTO DE LOS CULTIVOS AXÉNICOS (aislado)
Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se
le hace crecer de nuevo). Seguramente, el investigador deseará obtener más
células para poder trabajar con ellas. Para cultivar microorganismos en el
laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo, líquido o sólido, con todos
los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios sólidos se hacen
generalmente, añadiendo agar a los líquidos (
La importancia de ser cultivo puro
Todos los microbiólogos saben que han de trabajar con cultivos axénicos
(puros) para que sus experimentos sean significativos. Pero incluso los
microbiólogos más experimentados han cometido errores alguna vez. Esto le
sucedió a Ralph Wolfe, uno de los microbiólogos americanos más
distinguidos.
En 1960 Wolfe obtuvo un cultivo puro de la bacteria Methanobacillus
omelianskii. Este microorganismo es anaerobio estricto, capaz de producir
metano (gas natural). Wolfe quería conocer de qué manera M. omelianskií
producía gas metano a partir de etanol y anhídrido carbónico. El
procedimiento estaba claro; tenía que lisar la bacteria y aislar las enzimas
que catalizan la reacción, en un tubo de ensayo. Esto, aunque suena
bastante simple, había sido intentado previamente por otros investigadores y
todos habían fracasado. Wolfe lo intentó durante todo un año y tampoco tuvo
éxito. De repente lo consiguió: una solución de enzima. Sintetizaba metano
en un tubo de ensayo! Se trataba de un descubrimiento espectacular, hasta
que un colega se preguntó si el cultivo era axénico.
Wolfe decidió volver a aislar el cultivo, pero en vez de añadir etanol y
anhídrido carbónico al mismo, añadió hidrógeno y anhídrido carbónico. En el
nuevo medio se desarrollaron colonias, pero cuando se transfirieron al medio
con etanol y anhídrido carbónico no crecieron. Iquest; ¿Qué había sucedido?
Un colega, M.J. Wolin, se dio cuenta de lo que estaba sucediendo. Aunque

22. M. omelianskii originaba colonias uniformes y aisladas en el medio original,
se trataba de una mezcla de dos bacterias. Una, designada cepa S, convertía
el etanol en hidrógeno gas. La otra, designada cepa M, convertía el hidrógeno
gas y el anhídrido carbónico en metano. Ninguna de las dos podía crecer
sola con etanol y anhídrido carbónico. Todos los experimentos de Wolfe se
habían realizado con un cultivo mixto y tuvieron que repetirse para averiguar
qué enzimas pertenecían a la cepa S y cuáles a la cepa M.
¿Qué lección puede aprenderse de la historia de Wolfe? Primero, que los
problemas técnicos (tales como obtener un cultivo axénico), aunque son tan
básicos que se explican en los textos introductorios, son reales e importunan
a los más prestigiosos investigadores. Segundo, que incluso un buen
microbiólogo puede equivocarse. Algunas especies pueden crecer juntas
(para formar un consorcio) y parecer un cultivo axénico cuando realmente no
lo son.
VI. CONCLUSIONES:
 Hemos aprendido a reconocer un caldo a diferencia de un agar. El
caldo es para muestras liquidas y el agar para muestras sólidas.
 Los medios químicamente definidos se preparan añadiendo al agua
destilada cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos
altamente purificados.
 Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el
laboratorio de microbiología pues sirven para identificar las bacterias
causantes de las enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que
son sensibles esas bacterias.
 La mayoría de las bacterias se desarrolla en un medio de cultivo
básico que contiene agua extracto de carne y pepsina.
 Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en
un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar.

23.  Hemos aprendido a reconocer y clasificar medios de cultivo por su
origen animal, vegetal y mineral.
 Hay que ser minuciosos en la composición de los caldos nutritivos
porque el incorrecto uso de ellos puede llevar al fracaso de nuestra
experiencia de manipular microorganismos.
VII. RECOMENDACIONES
 No se puede usar las manos porque eso puede llevar a que se
contamine el caldo nutritivo.
 esterilizar los materiales con que se va a trabajar.
 Rotular los tubos de ensayo indicando las sustancias que contienen
estos.
 La mesa del laboratorio debe estar libre para poder llevar acabo la
práctica.
 A la hora de vaciar el cultivo en los tubos de ensayo hay que hacerlo
de una manera rápida, minuciosa y la tapa enroscada de dicho tubo
debe estar la boca arriba sin contacto con el área de trabajo.
 No debemos acercar nuestra boca al medio de cultivo, hay que
recordar que debemos evitar todo contacto que pueda generar
contaminación.
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
 Ingraham, J. (1998). Introducción a la microbiología. Barcelona,
España.
 Reverte. Pérez, R., & Juárez, A. (1997). Bioquímica de los
microorganismos. Barcelona, España: Reverte.
 Wikipedia la enciclopedia libre.