1. AISLAMIENTO DE MIEMBROS DE LA
FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE
Dr. CÉSAR JULIO CÁCEDA QUIROZ
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS
E. P. de BIOLOGÍA - MICROBIOLOGÍA
3. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
• Los métodos más utilizados para la identificación microbiana, se
pueden clasificar en:
Métodos basados en criterios morfológicos
Métodos basados en tinción diferencial
Métodos basados en pruebas bioquímicas
Métodos basados en tipificación con fagos
Métodos basados en pruebas serológicas
Métodos basados en detección molecular
4. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA FAMILIA
ENTEROBACTERIACEAE
• Es el grupo más grande y heterogéneo de bacilos Gram negativos, con
importancia clínica:
Menos de 20 especies, son responsables de más del 95% de las
infecciones humanas
• Estos Géneros se han clasificado, según:
Sus propiedades bioquímicas
Su estructura antigénica (serotipificación), e
Hibridación y secuenciación de su material genético
5. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA FAMILIA
ENTEROBACTERIACEAE
• Son bacilos, Gram negativos, no esporulados.
• Generalmente fermentan la lactosa.
• Son catalasa (+)
• Son Oxidasa (-), es decir carecen de la enzima citocromo oxidasa.
• Son capaces de reducir nitrato en nitrito.
Fuente: Jawets, Melnick, y Adelberg's, 2010
6. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA FAMILIA
ENTEROBACTERIACEAE
• Generalmente móviles, mediante flagelos peritricos,
Excepto Salmonella gallinarum, S. pollurum (son inmóviles)
• Se encuentra en el suelo, agua, animales y plantas.
• Forman parte de la flora normal del hombre, algunos son patógenos.
Fuente: Jawets, Melnick, y Adelberg's, 2010
10. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA
ENTEROBACTERIACEAE
• Citrato de Simmon’s
• Prueba de la Ureasa
• Prueba del Voges – Proskauer
• Prueba del Rojo de Metilo
• Prueba del Sulfuro Indol Movilidad (SIM)
• Prueba de la Movilidad Indol Ornitina (MIO)
• Medio Triple Azúcar Hierro (Medio TSI)
• Agar Lisina Hierro (Medio LIA)
Fuente: Jawets, Melnick, y Adelberg's, 2010
12. ENTEROBACTERIACEAE DE IMPORTANCIA CLÍNICA
GRUPO Salmonella GRUPO Shigella
Lactosa (-) Lactosa (-)
Citrato (+), generalmente Citrato (-)
KCN (-) KCN (-)
Lisina (+) Lisina (-)
Ornitina (+) Ornitina (-)
H2S (+), la mayoría
S. typhi, S. paratyphi, S. enteritidis
S. cholerae – suis, S. gallinarum, etc.
S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei
13. ENTEROBACTERIACEAE DE IMPORTANCIA CLÍNICA
GRUPO Yersinia GRUPO Proteus - Morganella - Providencia
Lactosa (-) Lactosa (-)
Citrato (-) Citrato (+)
KCN (-) Fenilalanina (+)
Lisina (+) Ureasa (+), generalmente
Lisina (-)
Y. enterocolitica, Y. pestis,
Y. pseudotuberculosis
P. mirabilis, P. vulgaris, P. morganni: ureasa (+)
Providencia spp: ureasa (-)
14. ENTEROBACTERIACEAE:
PATÓGENOS OPORTUNISTAS
• Escherichia, Klebsiella, Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Proteus,
Morganella, Providencia, etc.
Forman parte de la flora normal del hombre y animales
• Producen infección cuando salen de su hábitat normal.
• Producen infecciones extraintestinales: infecciones urinarias, sepsis,
meningitis, abscesos, neumonías, otitis, sinusitis, meningitis, etc.
Fuente: Jawets, Melnick, y Adelberg's, 2010
15. ENTEROBACTERIACEAE:
PATÓGENOS OBLIGADOS
• Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia.
No forman parte de la flora normal del hombre, su presencia en
muestras clínicas es indicativa de infección.
• En países subdesarrollados, son la primera causa de etiología infecciosa.
• Generalmente produce infecciones intestinales, excepto Salmonella, que
produce sepsis, neumonía, etc.
Fuente: Jawets, Melnick, y Adelberg's, 2010
16. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
ENTEROBACTERIACEAE
Muestra: Orina, sangre, esputo, heces, etc.
Examen en fresco – Coloración Gram
Siembra en medios de cultivo
(Agar Mac Conkey, Agar S.S., agar EMB
Pruebas bioquímicas
Identificación serológica - Antibiograma
17. Tabla 01
Pruebas bioquímicas para miembros de la Familia Enterobacteriaceae
Ornitina Fenil
alanina
Gas Sorbitol Lactosa Inositol Ramnosa Arabinosa Manitol
Escherichia D - + + + - D + +
Shigella D - - D - - D D +/-
Edwardsiella + - + - - - - - -
Salmonella + - + + - D + + +
Arizona + - + + D - + + +
Citrobacter D - + + D - + + +
Klebsiella - - + + + + + + +
Enterobacter + - + + + + + + +
Serratia + - + + +/- D - - -
P. vulgaris - + +/- - - +/- - - D
20. MEDIOS DE CULTIVO
• Medios de Enriquecimiento: Caldo Selenito de Leifson, Caldo
Tetrationato de Kauffman, Caldo Rappaport - Vassiliadis
• Medios Selectivos: Agar Mac Conkey, Agar E.M.B., Agar Endo, Agar
S.S., Agar Verde Brillante, Agar Sulfito Bismuto
• Medios Diferenciales: TSI, LIA, Agar Citrato de Simmons, agar urea
Fuente: Jawets, Melnick, y Adelberg's, 2010
22. SIEMBRAS PRIMARIAS
• Son importantes para aquellos gérmenes que no crecen en medios de
enriquecimiento, como Shigella.
En primer lugar, se recomienda el XLD (Xilosa Lisina Desoxicolato)
El XLD puede ser reemplazo por el EMB (Eosina Azul de Metileno),
excelente para el aislamiento de Shigella, o
Por el medio Desoxicolato Citrato (DC) o por el Hektoen agar (HA).
24. B. ENRIQUECIMIENTO
• El medio de enriquecimiento es necesario para Salmonella. Hay varios
medios de enriquecimiento:
El CALDO SELENITO permite el crecimiento de Salmonella typhi
El color de este medio debe ser amarillo claro y transparente.
El medio Selenito oxidado, es de color rojizo, y tiene capacidad
inhibitoria, razón por la cual no debe ser usado.
25. B. ENRIQUECIMIENTO
• Una vez sembrada la placa para el aislamiento primario (XLD o EMB)
colocar el hisopo en el CALDO SELENITO, tratando de exprimirlo contra las
paredes del tubo. Dejar el hisopo en el interior del tubo.
Incubar a 35 – 37 ºC, por 18 – 24 horas.
• El caldo, después de este periodo de incubación, se habrá tornado
ROJO LADRILLO.
• La prolongación de la incubación del Caldo Selenito por 5 días mejora,
en muchos casos, la recuperación de Salmonella, en especial S. typhi.
26. C. SIEMBRA A PARTIR DEL ENRIQUECIMIENTO
• Los medios de cultivo que se utilizan para sembrar, a partir del Caldo
de Enriquecimiento:
Son más inhibidores de la flora en general y particularmente
de la coliforme, y
Están dirigidos al aislamiento de Salmonella.
27. C. SIEMBRA A PARTIR DEL ENRIQUECIMIENTO
• Se sugiere el uso del medio del Agar S.S., el cual permite el
crecimiento de S. typhi y otras salmonelas.
• PROCEDIMIENTO:
Obtener una asada, sin agitar, del Caldo Selenito, incubado a 37
ºC, por 18 – 24 horas.
Realizar la siembra en 4 cuadrantes en el Agar S. S.
Incubar la placa a 35 – 37 ºC., por 18 a 24 horas.
28. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
• Las colonias sospechosas de Salmonella o Shigella, que se
encuentren en las placas de siembra directa (XLD y EMB), como del
enriquecimiento (Agar S.S.),
Serán transferidos a los medios de diferenciación bioquímica
primaria.
• La diferenciación bioquímica comprende los siguientes pasos:
29. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
A. Selección de colonias
• Se procederá a la selección de unas 5 colonias, marcadas.
• En el caso de Salmonella o Shigella, muestran características propias
en cada medio de aislamiento, que permite sospechar su presencia:
30. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
A. Selección de colonias
• Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD)
Salmonella: Colonias rojas, rojas con punto negro, amarillas con
punto negro, o completamente negras.
Shigella: colonias rojas.
31. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
A. Selección de colonias
• Desoxicolato Citrato (DC) o en Eosina Azul de Metileno (EMB)
Salmonella y Shigella: Colonias translúcidas e incoloras.
32. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
A. Selección de colonias
• Salmonella – Shigella (Agar S. S.)
Salmonella: Colonias translúcidas e incoloras, algunas se
presentan con bordes incoloros y el centro negro.
Shigella: Colonias translúcidas e incoloras.
33. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
A. Selección de colonias
• Hektoen Agar (HA)
Salmonella: Colonias verdosas o verde azuladas, con o sin centro
negro.
Shigella: Colonias verde o azuladas, sin centro negro.
34. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
B. Inoculación de los medios TSI y LIA
• Inocular los tubos de TSI y LIA con la misma colonia.
• Tomar la colonia del medio sólido, evitando tocar el fondo del medio de
cultivo, ni otra colonia vecina.
• Punzar una sola vez el medio de cultivo TSI, introduciendo el alambre por el
centro, hasta tocar el fondo del tubo. Retirar por el mismo trazo y sembrar
en estría la parte inclinada.
35. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
B. Inoculación de los medios TSI y LIA
• Con el resto que ha quedado en la misma asada, sin volver a tocar la
colonia, punzar 3 veces el espesor del medio LIA hasta el fondo del tubo,
terminando, asimismo, en estría en su parte inclinada.
• Colocar en la boca del tubo de LIA la tira de papel para indol, cuidando de
hacerlo a tal altura que no tenga contacto con el agar.
• Incubar ambos tubos a 35 ºC – 37 ºC, por 18 a 24 horas.
36. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
C. Lectura, simbolización e interpretación del TSI y LIA
TSI
• El medio tiene 3 azúcares: Glucosa, lactosa y sacarosa
• El hierro es el indicador para poner en evidencia el H2S.
La producción de H2S se manifiesta por el color negro en el medio. Se
simboliza de acuerdo a su intensidad: de 1 + a 4 +.
• La acidez se pone de manifiesto por su cambio al color amarillo y se
simboliza con la letra A.
37. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
C. Lectura, simbolización e interpretación del TSI y LIA
TSI
• La alcalinidad en el medio se manifiesta por el cambio al color
grosella, y se simboliza con la letra K.
• El ataque de glucosa se manifiesta por la alcalinidad en la parte
inclinada (K), y acidez en el fondo (A). Se simboliza K/A.
38. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
C. Lectura, simbolización e interpretación del TSI y LIA
TSI
• El ataque de lactosa y/o sacarosa se manifiesta por el cambio total del
medio al color amarillo. Se simboliza A/A.
A/A- -
A/A++ ++++
A/A+++ -
39. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
C. Lectura, simbolización e interpretación del TSI y LIA
TSI
• Los gérmenes que no atacan a ninguno de los azúcares del TSI no
pertenecen a la familia Enterobacteriaceae.
• El color del medio, a pesar del crecimiento bacteriano, es casi igual
al original, y se simboliza N/N.
42. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
C. Lectura, simbolización e interpretación del TSI y LIA
LIA
• El medio tiene en su composición glucosa y el indicador azul de
bromocresol.
• El color original del medio es LIGERAMENTE AZULADO (pH 6,7)
• La DESCARBOXILACIÓN de la lisina produce ALCALINIDAD en todo el
medio, por lo tanto, el color azulado se intensifica. Se simboliza K/K.
Este tipo de reacción se considera como LISINA POSITIVA.
43. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
C. Lectura, simbolización e interpretación del TSI y LIA
LIA
• La DESAMINACIÓN empieza en la parte inclinada, variando esta porción al color ROJO
LADRILLO. El fondo del medio se tornará AMARILLO. Esta reacción se interpreta por
motivos práctico como LISINA NEGATIVA. Se simbolizará como R/A.
• En los casos en que no se produce ninguna de las dos reacciones descarboxilación o
desaminación, el medio LIA se observará azulado en la parte inclinada y amarilla en el
fondo, por fermentación de la glucosa: Esta reacción se simboliza K/A.
A veces el medio puede presentarse amarillo en su totalidad, simbolizándose A/A: Estas
dos lecturas se interpretarán como LISINA NEGATIVA, y se simbolizará R/A, K/A o A/A.
44. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
C. Lectura, simbolización e interpretación del TSI y LIA
LIA
• La REACCIÓN DEL INDOL se interpretará como positiva por la aparición
del color rosado en la tira del papel de filtro, colocada en la boca del tubo
LIA.
• El símbolo positivo (+) o negativo (-) correspondiente a la lectura de
indol, se simbolizará con la reacción en LIA.
45. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
C. Lectura, simbolización e interpretación del TSI y LIA
LIA
• En los casos en que el color del medo LIA no haya variado sustancialmente, a
pesar del crecimiento bacteriano, se representará N/N, y por lo tanto no
corresponderá a las Enterobacteriaceae.
Esto se puede presentar por que la acidez, producto del ataque a glucosa, se
neutraliza por la alcalinidad producida por la descarboxilación, o bien,
porque el germen ha sido incapaz de utilizar la glucosa.
En este último caso, el germen mostrará un lia igualmente N/N y, por lo
tanto, no corresponderá a las Enterobacteriaceae.
46. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
C. Lectura, simbolización e interpretación del TSI y LIA
LIA
• En los casos en que el color del medo LIA no haya variado sustancialmente, a
pesar del crecimiento bacteriano, se representará N/N, y por lo tanto no
corresponderá a las Enterobacteriaceae.
Esto se puede presentar por que la acidez, producto del ataque a glucosa, se
neutraliza por la alcalinidad producida por la descarboxilación, o bien,
porque el germen ha sido incapaz de utilizar la glucosa.
En este último caso, el germen mostrará un TSI igualmente N/N y, por lo
tanto, no corresponderá a las Enterobacteriaceae.
47. TSI LIA (-) CIT (-) UREA (-) SIM
Shigella dysenteriae
58. CITRATO DE SIMMON’S
• Color del medio de cultivo: verde
• Indicador: Azul de Bromocresol
• Sustrato principal: Citrato de sodio
• Incubación: A 35 °C durante 24 a 48 horas.
Fuente: Jawets, Melnick, y Adelberg's, 2010
59. CITRATO DE SIMMON’S
• La utilización del Citrato por la bacteria que se va ha probar:
Se detecta en el medio de Citrato de Simmon’s por la producción
de subproductos alcalinos.
• Prueba positiva: Azul oscuro; Prueba negativa: Verde.
Fuente: Jawets, Melnick, y Adelberg's, 2010
60. CITRATO DE SIMMON’S
• El medio contiene Citrato de sodio, que es un anión, como única fuente
de carbono, y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno.
• Las bacterias que pueden utilizar el citrato también pueden extraer
nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoniaco (NH+),
Lo que produce la alcalinización del medio por conversión del NH+ a
Hidróxido de amonio (NH4OH)
Fuente: Jawets, Melnick, y Adelberg's, 2010
61. CITRATO DE SIMMON’S
• El indicador es el azul de bromotimol, que es amarillo por debajo de
pH 6,0 y azul por encima de pH 7,6.
64. UREASA
• Color del medio: amarillo claro
• Indicador: Rojo de Fenol
• Sustrato Principal: Urea
• Medios de cultivo: Caldo urea de Stuart, o Agar urea de Christensen
65. UREASA
• La urea es una diamida del ácido carbónico
• Todas las amidas se hidrolizan fácilmente, con liberación de amoniaco y
dióxido de carbono.
• El amoníaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio,
lo que produce alcalinización y aumento del pH del medio
67. UREASA
RESULTADOS
• Los M’os que hidrolizan la urea rápidamente pueden producir
reacciones positivas en 1 o 2 horas.
• Las especies menos activas pueden requerir 3 días o más. Las
reacciones son las siguientes:
Fuente: Jawets, Melnick, y Adelberg's, 2010
68. UREASA
1. Caldo de Stuart
• Un color rojo en todo el medio indica alcalinización
e hidrólisis de la urea.
Fuente: Jawets, Melnick, y Adelberg's, 2010
69. UREASA
2. Agar de Christensen
• Degradadores rápidos de urea (Proteus
spp): color ROJO en todo el medio.
• Degradadores lento de la urea (Klebsiella
spp): Inicialmente color rojo sólo en el pico
de flauta, que gradualmente se extiende a
todo el tubo.
70. UREASA
3. Ausencia de hidrólisis
• Ausencia de hidrólisis de la urea: El
medio conserva su color amarillo original
72. VOGES - PROSKAUER
• Voges – Proskauer es un epónimo doble, en honor a dos
microbiólogos que trabajaron a principios del siglo XX.
• Estos investigadores fueron los primeros en observar la reacción de
color rojo, producida en medios de cultivo adecuados después del
tratamiento con KOH.
• Luego se descubrió que el producto activo del medio, formado por
el metabolismo bacteriano, es el acetil metil carbinol, producto de
la vía del butilenglicol.
73. VOGES - PROSKAUER
• El ácido pirúvico, se metaboliza, dando como resultado la producción
de acetoína (acetil metil carbinol).
• Los M’os del grupo Klebsiella – Enterobacter – Hafnia – Serratia
producen acetoína,
Como producto metabólico final principal del metabolismo de la
glucosa, y forman cantidades pequeñas de ácidos mixtos.
74. VOGES - PROSKAUER
• En presencia de oxígeno atmosférico e hidróxido de potasio
(KOH) al 40%,
La acetoína se convierte en diacetilo, y
El α – naftol sirve de catalizador para producir un complejo de
color rojo.
75. VOGES – PROSKAUER: Procedimiento
• Sembrar un tubo de caldo RM/VP con un cultivo puro del M’o por
probar. Incubar 24 horas a 35 °C.
• Después de la incubación, transferir 1 ml del caldo a un tubo de
ensayo limpio. Agregar 0,6 ml de α – naftol al 5%, seguidos de 0,2
ml de KOH al 40%.
Es esencial que los reactivos sean agregados en ese orden.
• Agitar suavemente el tubo, para exponer el medio al oxígeno
atmosférico y dejar el tubo en reposo durante 10 a 15 minutos.
76. VOGES – PROSKAUER: Resultados
• Positivo: Desarrollo de color rojo 15 minutos o más, después del
agregado de los reactivos, que indica la presencia de diacetilo, el
producto de oxidación de la acetoína.
• La prueba no debe leerse más allá de una hora después de dejar los
tubos en reposo, porque los cultivos Voges-Proskauer negativos pueden
producir un color cobrizo, que se puede interpretar como un falso (+).
78. ROJO DE METILO
• El Rojo de Metilo es un indicador de pH con un rango entre 6
(amarillo) y 4,4 (rojo).
• El pH al cual el RM detecta los ácidos es mucho más bajo que el pH
correspondiente a otros indicadores utilizados en medios de cultivos
bacteriológicos.
Por lo tanto, para provocar un cambio de color, el M’o en estudio
debe producir grandes cantidades de ácido del sustrato de
glúcidos que se utilice.
80. ROJO DE METILO: Resultados
• Positivo: El desarrollo de color rojo estable
en la superficie del medio, indica:
La suficiente producción de ácido, como
para disminuir el pH a 4,4
81. ROJO DE METILO: Resultados
• Negativo: Como otros M’os pueden producir
pequeñas cantidades de ácido del sustrato
probado,
Puede observarse un color naranja,
intermedio entre amarillo y rojo.
Esto no indica una prueba (+)
85. INDOL
• Es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido
triptófano.
• La prueba del indol se basa en la formación de un complejo de
color rojo, cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-
dimetilaminobenzaldehído.
• En la práctica se utilizan medios combinados, como el medio de
sulfuro indol para motilidad (SIM), el medio para motilidad indol
ornitina (MIO), o el medio indol nitrato.
86. SIM: SULFURO INDOL MOVILIDAD
• Determinar si un M’o es móvil o inmóvil, si es capaz de:
Liberar H2S por acción enzimática de los aminoácidos que
contienen azufre, produciendo una reacción visible de color negro,
y
Por último la capacidad de desdoblar el indol de la molécula de
triptófano.
88. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO
• La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una
reacción de reducción que da un sulfito y un sulfato.
• El gas incoloro H2S reacciona con una sal pesada, el citrato férrico
de amonio, para producir un ppdo negro insoluble, el sulfato ferroso.
89. PRODUCCIÓN DE INDOL
• El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas
bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e
indolacético
• La formación de indol se produce solamente en aquellos organismos
capaces de fermentar los carbohidratos.
91. RESULTADOS DEL INDOL
• Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio.
• Negativo: No se produce color / color naranja en la superficie del medio
indica desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser
precursor de la formación de indol.
• La reacción positiva después de 24 horas indica una prueba completa. Si el
cultivo de 24 horas es negativo, deberá incubarse otras 24 horas y repetirse
la prueba.
93. RESULTADOS DE MOVILIDAD
• Positivo: Los organismos móviles migran de
la línea de siembra y se difunden en el
medio, provocando turbiedad.
• Negativo: Crecimiento bacteriano
acentuado, siguiendo la línea de siembra.
94. Bacterias Producción de H2S Producción Indol Movilidad
Salmonella typhi +/- - +
Salmonella +/- - +
E. coli - + +/-
Klebsiella - +/- -
Enterobacter - - +
Citrobacter + - +
Shigella - +/- +/-
95. DESCARBOXILACIÓN DE LA ORNITINA
• Descarboxilación de Ornitina: Mide
la capacidad enzimática de un
organismo para descarboxilar un
aminoácido para formar una amina,
con la consiguiente alcalinidad.