Preparacion de medios de cultivo

MEDIOS DE CULTIVO
Mblgo. Ms. C. Juan Wilson Krugg
jwkrugg@hotmail.com
1

GENERALIDADES
El crecimiento de
microorganismos en
sustancias alimenticias
artificiales es una de las
técnicas más importantes
usadas en el laboratorio.
2

GENERALIDADES
• Permite reconocer las
características
culturales de las
bacterias.
• A partir de estas se
puede obtener cultivos
puros 3

MEDIO DE CULTIVO
• Conjunto de nutrientes,
factores de crecimiento y
otros componentes.
• Se crean condiciones
adecuadas de desarrollo y
reproducción de manera
artificial.
• No existe un medio universal
común.
5

• Para su óptimo crecimiento es necesario dar condiciones ambientales
adecuadas para su desarrollo en medios artificiales.
• Estas son: temperatura, pH, humedad, presión de oxígeno, grado de acidez o
alcalinidad del medio…
6

• Las características más importantes de los microorganismos a ser
consideradas al momento de preparar un medio de cultivo son:
 Tipo trófico: autótrofos, heterótrofos, quimiotrofos, fotótrofos.
 Tipo respiratorio: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos,
microaerófilos.
 Temperatura: psicrófilos, mesófilos y termófilos.
 pH: acidófilos, neutrófilos, basófilos.
7

REQUERIMIENTOS DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO
Requerimientos energéticos y no energéticos
Salvo excepciones, las bacterias son cultivables en medios artificiales de
laboratorio de tal forma que el medio de cultivo le proporciona los
elementos necesarios para su crecimiento y multiplicación. De acuerdo
con esto, siempre se requerirá una fuente de energía y una fuente no
energética como son las sales, factores de crecimiento, etc., que sin
proporcionar energía son necesarias para su desarrollo.
Los requerimientos energéticos son los nutrientes de ese medio de
cultivo, que va a ser utilizado por la bacteria para su crecimiento. Van a
ser fuentes de energía en un medio de cultivo, al menos, una fuente de
carbono y una fuente de nitrógeno, y fuentes no energéticas pueden
ser una fuente de fósforo, determinados iones como el hierro, el
potasio, el sodio, el zinc, el magnesio, etc.
8

REQUERIMIENTOS ENERGETICOS
Entre los requerimientos energéticos de los medios de
cultivo tenemos:
• 1. Fuente de Carbono
• 2. Fuente de Nitrógeno
9

• FUENTES DE CARBONO
 Pueden ser CO2 o compuestos carbonados orgánicos.
 Se utilizan en la construcción de innumerables moléculas necesarias para la
célula.
 Los hidratos de carbono se consideran fuente de carbono y energía.
 Existen muchos tipos de fuentes de carbono, ya que esto está ligado al
metabolismo energético de la especie microbial; por ejemplo:
10

Fuentes de carbono
Algunas bacterias son capaces de utilizar sustancias muy sencillas como ácido
acético, alcohol, citrato sódico, etc.
En otras ocasiones, la mayor parte de los casos, la fuente de carbono
corresponde a azúcares en forma de mono o disacáridos, como glucosa,
lactosa, maltosa, etc.,
Incluso hay microorganismos que pueden utilizar azúcares más complejos
para obtener energía, como es el caso del almidón.
Existen también bacterias capaces de utilizar el gas carbónico CO2 hecho que
es característico de las bacterias fotosintetizantes y quimiolitótrofas.
11

Fuentes de carbono
Otros microorganismos pueden crecer a expensas del
metano, benceno e, incluso, hidrocarburos como fuente
de energía: Ejemplo: Cladosporium.
Por último, existen especies de Pseudomonas, que
pueden utilizar como fuente de energía un gran número
de componentes hidrocarbonados diferentes.
En general, conocer el tipo de azúcar utilizado por cada
bacteria es muy útil para su identificación bioquímica y
consiguiente clasificación taxonómica.
12

• FUENTE DE NITRÓGENO
 Es metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de
pared.
 Algunos microorganismos pueden incorporar nitrógeno en forma de
aminoácidos, bases purínicas o pirimidínicas.
 En ciertos medios de cultivo, el aporte de nitrógeno es realizado por las
peptonas
13

Fuente de nitrógeno
Bastante menos energética que la fuente de carbono pero necesaria para el
metabolismo microbiano, produciendo también energía.
Son fuente de nitrógeno las proteínas, péptidos o aminoácidos. Pueden
presentarse como proteínas completas, que sería el caso de la gelatina cuya presencia
sirve para determinar la actividad proteolítica o gelatinasa del microorganismo
problema, o incluso proteínas aún más complejas, como es el caso de los extractos de
carne, sales de amonio, etc.
.
14

2. Fuente de nitrogeno
Existen muchos tipos de peptonas y son
excelentes fuentes de nitrógeno.
Entre las más frecuentes y conocidas se
encuentran los extractos de levadura que son
extractos hidrosolubles preparados a partir de un
lisado de levadura que se utiliza en muchos medios
de cultivo.
El bio-Thione, es una denominación comercial
correspondiente a una peptona pépsica de carne
empleada para la preparación, por ejemplo, del
medio líquido Sabouraud.
Tiene una alto contenido de azufre y de ahí que
en los medios de cultivo que la contengan se pueda
utilizar para investigar la producción de sulfuro de
hidrógeno (SH2) por parte de la bacteria problema.
15

2. Fuente de nitrogeno
La caseina: es una peptona sometida al proceso
de digestión ácida muy utilizada en muchos medios
de cultivo, sobre todo, en forma de peptona tripsica
de caseina; por ejemplo: para estudiar la formación
de indol por parte de la bacteria debido al alto
contenido de triptófano que posee este tipo de
peptona.
También es utilizada para estudiar la reducción
de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos
protozoos.
La peptona papaínica de soja, es una fuente de
nitrógeno especialmente para hongos y ciertos
gérmenes exigentes como en el caso de las
Neisserias.
Otra fuente de nitrógeno sería la utilización de
nitratos, nitrógeno orgánico, amoniaco, sales de
amonio, aminoácidos, etc.
16

REQUERIMIENTOS NO ENERGETICOS
Entre los requerimientos no energéticos de los medios de
cultivo tenemos:
• 1. Fuente de azufre
• 2. Fuente de fósforo
• 3. Iones metálicos
• 4. Factores de crecimiento
• 5. Factores de arranque
• 6. Factores inhibidores
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• 1. FÓSFORO
 Se agrega fosfatos de sodio
o potasio.
 El fósforo se incorpora a
ácidos nucleicos,
fosfolípidos, polímeros de
membrana, ATP, y
sustancias de reserva.
• 2. AZUFRE
 Se adiciona como SO4,
cisteína o metionina.
 En la célula se incorpora
a aminoácidos y
diferentes coenzimas.
18

3. K+
, Mg2+
, Ca2+
 Son cationes que estabilizan
macromoléculas aniónicas.
 K+
actúa como coenzima y
estabilizador de RNA.
 Mg2+
se integra a la clorofila en
organismos fotosintéticos.
 Ca2+
abunda en esporas como
dipicolinato de calcio.
4. Na
 Contribuye a equilibrar la
presión osmótica del medio
extracelular.
 Se suele suministrar como
NaCl.
19

5. Factores de Crecimiento
No todas las bacterias son capaces de crecer sobre medios donde se
encuentran cubiertas las necesidades elementales.
Existen bacterias que aún así no crecen en tales medios o, si lo hacen, es
muy lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta además una serie
de componentes definidos que muchas bacterias no son capaces de
fabricar por sí solas para su crecimiento.
A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a
corresponder a algún tipo de aminoácido de bacterias muy exigentes o
incluso vitaminas, bases púricas o pirimidinicas, etc.
Agar sangre enriquecido con metionina, ácido glutámico y ácido nicotínico
para el crecimiento de Xanthomonas.
20

FACTORES DE CRECIMIENTO
• Son compuestos orgánicos requeridos en muy bajas concentraciones.
• No pueden ser sintetizados por la propia célula.
• Deben ser agregados al medio de cultivo
• Pueden ser aportados en forma de:
 Extracto de carne
 Extracto de levadura
 Extracto de malta
21

Haemophyllus
El Agar Chocolate permite el
desarrollo de colonias húmedas,
lisas y grises del Haemophylus
influenzae.
Este medio contiene hematina
(factor X) y está enriquecido con
otros cofactores, como el NAD
(factor V), que permite el
desarrollo de este
microorganismo.
AGAR CHOCOLATE
22

Bordetella
Agar Sangre enriquecido con
Glicerol - papa (Bordet Gengou)
para crecimiento de Bordetella
pertusis.
Se observa colonias en “gotas de
mercurio” brillantes es fácil de
apreciar.
AGAR SANGRE
23

6. Factores de Arranque
Son sustancias que van a permitir
a la bacteria en estudio, salir de su
fase de latencia y comenzar su
fase de crecimiento exponencial
.
Son fundamentalmente fuentes de
energía ”glucosa” que es utilizado
por las bacterias.
Un factor de arranque puede ser
una fuente no energética como
algún ión que estimule el
crecimiento.
24

7. Factores Inhibidores
Son componentes que van a impedir el crecimiento de algún tipo de
microorganismo por bloqueo de sus procesos metabólicos.
Los antibióticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria.
La azida sódica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.
Algunos colorantes : Eosina Azul de metileno impide el crecimiento
bacteriano de los Grampositivos.
Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.
Las sustancias inhibidoras son muy útiles para la identificación y
tipificación de pruebas bioquímicas de las bacterias.
Agar Mac Conkey :
Agar Eosina Azul de Metileno
Agar Salmonella Shigella
Agar Verde brillante
25

AGAR MAC CONKEY
TIPO DE COLONIAS
Superficie de agar Mac Conkey con desarrollo de colonias a las 24 horas.
Se observa colonia rojas fermentadoras de lactosa, el color rojo se debe a
que el microorganismo produce grandes cantidades de ácido mixtos.
Se observa colonias no fermentadoras de lactosa, son colonias pequeñas y
transparentes.
26

AGAR EOSINA AZUL DE METILENO
El medio EMB contiene Eosina
y azul de metileno que son
colorantes de anilina y van a
inhibir el crecimiento de los
microorganismos
Grampositivos, permitiendo el
crecimiento de todas las
Enterobacterias.
Las colonias que fermentan la
lactosa y/o sacarosa se observan
de un color púrpura. Las que no
fermentan lactosa ni sacarosa se
observan incoloras.
La Escherichia coli se observa
de color púrpura y con brillo
metálico. 27

AGENTES SOLIDIFICANTES
• Su uso es opcional y el más usado es el agar.
• Se le adiciona en diferentes
concentraciones.
 1.5 – 2 % en medios sólidos
 0.2 – 0.3% en medios semisólidos
 5% en medios de consistencia firme
28

COMPOSICIÓN QUÍMICA – AGUA
• Representa del 80-90% del peso total de una
célula.
• Es fundamental para la realización de todos los
procesos metabólicos, funciones enzimáticas ….
• Los medios de cultivo se preparan en el
laboratorio con agua destilada.
29

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS
DE CULTIVO
35

PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS
DE CULTIVO
Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, así como diferentes
clasificaciones. De acuerdo a esto y según criterios se podrían dividir:
1. SEGÚN SU PROPORCION EN AGUA
2. SEGÚN SU USO O UTILIZACIÓN
3. SEGÚN LA COMPOSICIÓN QUE PRESENTEN
4. SEGÚN SU PRESENTACIÓN
36

SEGÚN SU PROPORCIÓN DE AGUA
1. Medios sólidos.
2. Medios líquidos.
3. Medios semisólidos
37

1. MEDIOS SOLIDOS.
Corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar es igual o
mayor al 1.5% . Koch utilizó, en 1881, por primera vez la gelatina para obtener
un medio sólido; posteriormente un alumno suyo, Hesse, utilizaría en su lugar
agar.
En la actualidad, para la solidificación de los medios se utiliza el agar, ya que
la gelatina presenta el inconveniente de fundir a unos 24ºC, además existen en
bacteriología numerosas bacterias gelatinasa positiva que destruirían tal medio.
Los medios sólidos permiten el aislamiento, purificación y visualización
del crecimiento microbiano en colonias, así como su posible identificación a través
de medios específicos y diferenciales de caracteres sólidos, elaboración de
antibiogramas, etc.
38

1. MEDIOS SOLIDOS.
Agar Sangre, observar la morfología de las colonias y el tipo de hemolisis.
Agar Mac Conkey, los diferentes tipo de colonias de acuerdo al consumo
de lactosa.
Agar Mueller Hinton, prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
39

AGAR SANGRE
HEMOLISIS
Los Streptococcus se clasifican en base a su propiedades hemolíticas en agar
sangre.
La hemolisis parcial de los eritrocitos da como un resultado un color verdoso
del medio sólido que rodea las colonias (alfa-hemolisis).
Los que producen hemolisinas que lisan los eritrocitos, produce un
aclaramiento del medio que rodea las colonias (beta-hemolisis).
40

Cultivo mixto que demuestra la presencia
de dos tipos de microorganismos:
Un tipo de colonias grandes, blancas
pertenecientes a Staphyloccous.
El otro tipo de colonias puntiforme
pertenecientes a Streptococus.
AGAR SANGRE
41

AGAR MUELLER HINTON
ANTIBIOGRAMA
Se basa en la difusión del
antibiótico sobre el agar, y
determinar la sensibilidad
(formación de halo alrededor
del antibiótico) y/o
resistencia (crecimiento
alrededor del antibiótico).
42

2. MEDIOS LIQUIDOS.
También se denominan caldos, no contienen agar y su composición,
además de agua suele contener al menos una fuente de carbono, sales
minerales, y, en algunas ocasiones según las características del medio,
factores de crecimiento, vitaminas, peptonas, ciertos aminoácidos, etc.
Son de gran utilidad para la realización de recuentos bacteriológicos por
turbidimetría, especialmente útil en levaduras, para la realización de inóculos,
obtención de productos metabolitos primarios o secundarios, creados por los
propios microorganismos como, por ejemplo, antibióticos, ácidos lácticos, etc.
Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradación de glucosa
Caldo Peptona, para investigar la producción de Indol.
Caldo Lactosado, para investigar la formación de ácido y gas
43

La formación de indol a partir del
triptofano se indica por un color
rojo despues del agregado del
reactivo de Kovac.
El tubo del la izquierda es
negativo.
El tubo de la derecha demuestra un
halo de color rojo lo que indica la
presencia de Indol.
INDOL
44

3. MEDIOS SEMISÓLIDOS.
Son medios intermedios entre los medios líquidos y los sólidos donde su
proporción en agar suele ser inferior al 0.5% pero siempre suelen presentar
una cierta cantidad que le proporcione una consistencia semisólida.
Son útiles para ciertas pruebas bioquímicas como por ejemplo, la prueba de
oxidación- fermentación, que permiter conocer el tipo de metabolismo
oxidativo o fermentativo de la bacteria problema.
Agar O-F Hugh Leiffson
Agar SIM, estudiar movilidad, Producción de H2S, Indol.
Agar MIO, estudiar movilidad, Producción de Indol y Ornitina.
45

Tubo con medio para motilidad
y producción de ácido
sulfihidrico.
Los microorganismos móviles
muestran desarrollo difuso hacia
fuera de la línea de siembra.
Los microorganismos inmóviles
crecen solamente a lo largo de
la linea de siembra por punción
exterior.
Se observa un color Negro
debido a la producción de H2S
SIM
46

SEGÚN SU PRESENTACION
1. Medios deshidratados o liofilizados.
2. Medios ya preparados:
A. Sólidos en placa petri.
B. Sólidos en tubo.
B.1. Inclinado
B.2. Semi-inclinado (pico de flauta)
C. Líquidos en tubo.
D. Semisólidos en tubo.
E. De doble fase en frasco o tubo.
47

POR SU PRESENTACION
1. MEDIOS DESHIDRATADOS
Son medios que se comercializan
tal cual y una vez en el laboratorio
deben ser preparados adicionando la
cantidad de agua correspondiente en
condiciones totalmente asépticas o
una vez preparados en estas
condiciones lo esterilizaríamos en el
autoclave.
Su composición es muy variable y
puede ser de tipo básico o más
complejo.
48

POR SU PRESENTACION
2. MEDIOS YA PREPARADOS
Son medios que han sido
elaborados por las casas comerciales
presentando un determinado control
de calidad y características específicas
adecuadas a cada tipo de cultivo.
Este tipo de medios pueden
presentarse en forma de placas, en
tubo, como formas sólidas, en frascos,
como medios semisólidos o líquidos, en
sistemas de doble fase, etc.
49

MEDIOS DE CULTIVO
SEGÚN SU USO O UTILIZACION
1. Medios para aislamiento.
A. Enriquecidos
B. De enriquecimiento
B. Selectivos
C. Diferenciales
2. Medios para crecimiento general.
3. Medios para identificación.
4. Medios para mantenimiento de cepas.
50

1. MEDIOS PARA AISLAMIENTO
Son medios muy diversos pero con la particularidad común de poder obtener a
partir de ellos colonias aisladas. Estos, según sea su composición, se pueden a
su vez dividir en:
A. MEDIOS ENRIQUECIDOS
Son medios a los cuales, como su nombre indica, se les añade además de los
componentes básicos, uno o varios elementos, como por ejemplo caseína soja,
triptófano, etc., que facilitan el crecimiento de algún tipo de microorganismo
generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el microorganismo que
buscamos.
51

B. MEDIOS SELECTIVOS
Son medios en cuya composición presentan algún componente o
componentes que van a impedir el crecimiento de algún tipo bacteriano,
estableciendo con ello una selección en el tipo de microorganismo que sí
puede crecer; por ejemplo, el medio Selenito (Salmonella Shigella Proteus),
contiene en su composición selenito que inhibe a la flora Grampositiva
52

C. MEDIOS DIFERENCIALES
Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades
que los medios selectivos, es decir, tienen componentes que inhiben el
crecimiento de algunas bacterias y, lo que es más característico de este
medio, presentan sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacterias que
van a crecer en dicho medio, dan una información suplementaria y específica,
es decir, diferencial; por ejemplo: El medio SS, Mac Conkey
Los medios diferenciales suelen ser también selectivos y se usan con fines de
aislamiento e identificación.
54

2. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERAL
Son medios ya sea en forma liquida o sólida que sirven para el cultivo de
la
mayor parte de las bacterias.
Su composición va a corresponder a una fuente de carbono, una fuente de
nitrógeno, sales y agua. Dentro de los medios generales más empleados
tendríamos el caldo común, que está compuesto por extracto de carne,
peptona, glucosa, cloruro de sódico y agua.
55

3. MEDIOS PARA IDENTIFICACIÓN
Son medios que pueden tener las mismas características que los diferenciales
tanto, nos van a servir para identificar el crecimineto y características de algún
tipo de microorganismo.
También podría corresponder a medios generales más o menos enriquecidos
con algún componente como, por ejemplo, peptona, urea, glucosa, etc., hecho
que nos va a servir para visualizar el tipo de metabolismo microbiano, por
ejemplo:
El caldo peptonado para saber si el microorganismo es indol +.
El medio urea para la ureasa +.
El caldo glucosado para saber la fermentación de la glucosa.
Este tipo de pruebas permite clasificar taxonomicamente el microorganismo.
56

Permite investigar que ruta metabólica ha
utilizado el microorganismo para consumir la
glucosa.
Si utiliza la vía de fermentación de los ácidos el
pH resultante es menor de 4.4, y el
microorganismo será Rojo de metilo (+) el cual
se va a evidenciar por el agregado del indicador
rojo de metilo y dará un color rojo (+) y
amarillo anaranjado (-).
Los microorganismos que utilizan la vía de la
acetoina serán Voges Proskauer (+) y se
evidencian por un color rojo al cabo de los 10
minutos después de agregar el KOH y el alfa-
naftol.
VP RM (CALDO GLUCOSADO)
57

La formación de indol a partir
del triptofano se indica por un
color rojo después del agregado
del reactivo de Kovac.
El tubo del la izquierda es
negativo.
El tubo de la derecha demuestra
un halo de color rojo lo que
indica la presencia de Indol.
INDOL
58

Tres tubos con caldo y con
tubos de Durham.
El tubo de la izquierda muestra
formación de ácido a partir de
glucosa (amarillo) y formación
de gas..
El tubo del centro muestra
formación de ácido a partir de
glucosa (amarillo).
El tubo de la derecha es
negativo (rojo).
UTILIZACION DE LA GLUCOSA
59

4. MEDIOS PARA MANTENIMIENTO DE
CEPAS.
Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a
las cepas vivas durante períodos de tiempo relativamente largos
manteniéndose tales medios generalmente a temperaturas lo
suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento.
Ejemplo: Leche descremada que congelada se utiliza a menudo para
mantener cepas durante meses.
60

MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN
LA COMPOSICION QUE PRESENTEN
1. Medios naturales.
2. Medios semisintéticos.
3. Medios sintéticos.
4. Medios complejos.
61

POR SU COMPOSICIÓN QUE PRESENTAN
1. MEDIOS NATURALES
Son aquellos cuyos componentes orgánicos e inorgánicos se
encuentran en la naturaleza, se suelen preparar artesanalmente y, en
general, pueden estar constituidos por ciertos tejidos, líquidos orgánicos,
etc., por ejemplo: la leche, que constituye un medio natural de
conservación y cultivo favorable para numerosas bacterias.
Se suele utilizar en forma de leche simple descremada, leche tornasolada
y leche con azul de metileno. Otros medios naturales son el huevo entero,
clara o la yema, o incluso la patata, que es ampliamente utilizada en
bacteriología para el aislamiento de muchos hongos.
62

2. MEDIOS SEMISINTETICOS
Son medios donde parte de su composición
corresponde a extractos naturales como levadura, malta,
patata, sangre, leche, etc., a los que se añaden
constituyentes sintéticos o químicamente definidos para
el
crecimiento bacteriano.
63

3. MEDIOS SINTETICOS
Corresponden a estructuras sintéticas más o menos puras y químicamente
definidas, que están o pueden estar disueltas en agua destilada en
proporciones determinadas de forma que se obtenga una solución adecuada
para permitir el crecimiento de microorganismo que se desee.
Su uso puede ser para aislamiento, identificación, crecimiento, determinación,
ensayo, mantenimiento, etc. Siempre deberán contener en su composición los
siguientes elementos:
Una fuente de Carbono o azúcar.
Una fuente de nitrógeno en forma inorgánica como iones NO-3, NH+4
, o en
forma orgánica, como peptona, aminoácidos, aminas, etc.
Compuestos minerales, y entre ellos, oligoelementos.
Factores de crecimiento.
Todo medio sintético puede presentar una complejidad muy variable de
elementos según el germen que se pretenda cultivar y estudiar.
64

4. MEDIOS COMPLEJOS o ESPECIALES
Son los primeros que se utilizaron en bacteriología, aunque en
la actualidad su uso está más restringido. Sin embargo, en
parasitología y virología se utilizan habitualmente. Se preparan de
forma compleja a partir de tejidos animales y más raramente de
vegetales.
Su composición no está exactamente definida como sucede en los
medios sintéticos, es decir, no es rigurosamente constante, y sus
materias primas suelen ser carne de músculo, de hígado, de corazón,
clara o yema de huevo, azúcares, peptonas, etc.
Medio de Lowenstein Jenssen.
Infusión cerebro corazón (BHI) 65

1. COMPOSICION
Fosfato monopotásico 4.0 g
Sulfato de magnesio 0.4 g
Citrato de magnesio 1.0 g
Asparragina 6.0 g
Glicerol 20.0 g
Agua destilada 1000 ml
2. PREPARACION
Disolver los ingredientes y hervir durante 2 horas.
Luego añadir 50 g de almidón de papa.
Cascar 5 huevos en condiciones asépticas en un
matraz y con ayuda de perlas de vidrio.
Agregar 50 ml de verde malaquita en solución al 2%
Distribuir en condiciones asépticas en tubos con
tapa de rosca y dejar solidificar.
3. FINALIDAD
Permitir el crecimiento de Mycobacterium.
MEDIO LOWENSTEIN JENSSEN
66

1. COMPOSICION
Infusión cerebro de ternera 20.0 g
Infusión corazón de res 25.0 g
Peptonas 10.0 g
Fosfato disódico 2.5 g
Glucosa 2.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Agua destilada 1000 ml
2. FINALIDAD
Permite el crecimiento de microorganismos considerados muy dificiles
de cultivar, en él los gérmenes mantienen su virulencia , antigenicidad
y otras características serológicas.
INFUSION CEREBRO CORAZON
67

CONTROL DE CALIDAD
 El Control de Calidad en la preparación y evaluación de los
medios de cultivo es considerado como una esencial y buena
práctica de laboratorio, necesario para mantener el nivel y la
ejecución de cualquier técnica microbiológica.
Proceso continuo que se extiende desde las materias primas ;
a través del productor hasta el producto final utilizado en los
diferentes departamentos de análisis y diagnóstico
microbiológico.
68

Recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés
(Productividad)
▪ Inhibición o suspensión de los microorganismos no
deseados (Selectividad)
▪ Propiedades bioquímicas (diferenciales y diagnósticas)
▪ Propiedades físicas (por ejemplo, pH, Volumen)
▪ Sea estéril .... etc.
 El Jefe inmediato responsable del área
* Deberá analizar mensualmente los resultados de las pruebas
realizadas por el responsable del departamento de control de
calidad
* Evaluará el cumplimiento de objetivos a través de los
resultados
69

CRITERIOS DE EVALUACIÓN DE LA CALIDAD
DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS PREPARADOS.
Se evalúa utilizando criterios objetivos del medio respecto a:
 La recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés
 La inhibición o supresión de los microorganismos no deseados tiene que ser
cuantitativa
 Los atributos ( por ejemplo: Propiedades físicas y bioquímicas)
 Rajadura del plato o envase
 Variaciones en el volumen del medio
 Hemólisis
 Cristales en el medio
 Presencia de burbujas
 Presencia de coágulos
 Cambio de color normal
 Contaminación
 Falla en la inhibición de microorganismos saprofitos
 Esterilidad
CRITERIOS DE EVALUACIÓN DE LA CALIDAD
DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS PREPARADOS.
Se evalúa utilizando criterios objetivos del medio respecto a:
 La recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés
 La inhibición o supresión de los microorganismos no deseados tiene que ser
cuantitativa
 Los atributos ( por ejemplo: Propiedades físicas y bioquímicas)
 Rajadura del plato o envase
 Variaciones en el volumen del medio
 Hemólisis
 Cristales en el medio
 Presencia de burbujas
 Presencia de coágulos
 Cambio de color normal
 Contaminación
 Falla en la inhibición de microorganismos saprofitos
 Esterilidad
70

Cátedra de Micología
Mblgo. Juan Wilson Krugg
71

PREPARACIÓN – MEDIO DE
CULTIVO
72

INTRODUCCION
Para poder estudiar debidamente los microorganismos, se necesita como
requisito previo poder cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto
inicialmente deben ser aislados. Para ello, se dispone previamente de
muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas:
- Que no exista la cantidad suficiente del microorganismo que se busca.
- Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, los cuales
son contaminantes, haciéndose necesario su aislamiento inicial para
obtener cultivos puros.
Generalmente los procesos infecciosos están creados por un agente causal
sin
embargo, es fácil que puedan proliferar en esas condiciones otros
microorganismos oportunistas o incluso contaminantes. De ahí que una
forma
de evitar estos errores sea aislarlos inicialmente y posteriormente 75

MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION
Existen los siguientes materiales:
• Asas de siembra Hilos de platino
• Asas de Digrasky Hisopos
• Pipetas
76

1. ASAS DE SIEMBRA
• Son utilizadas para la inoculación o siembra por estría en medios sólidos, por
picadura en medios sólidos semisólidos y para la siembra de medios líquidos.
• Presentan un arco bastante cerrado en su extremo, cuyo diámetro es más o menos
específico es decir, muchas de las asas son calibradas correspondiendo a un
volúmen determinado de siembra. Las más utilizadas son las de 0,01 mililitro que se
esterilizan por flameado.
77

2. HILOS DE PLATINO
• Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su extremo,
únicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios
semisólidos o sólidos.
78

3. ASAS DE DIGRASKY
• Son asas de vidrio con forma de
triángulo más menos abierto.
• Se utilizan para extender el inoculo
líquido previamente adicionado en la
placa, por ejemplo, a través de pipeta
Pasteur.
• Se esterilizan en estufa, en autoclave,
aunque generalmente se puede hacer
metiéndola en alcohol y prendiendo
la llama hasta agotar el alcohol del
asa. 79

4. HISOPOS
• Se utilizan para la toma de muestras e incluso en muchos casos
llevan un medio de transporte incorporado que permite transportar
muestra sin que ésta sufra ninguna desecación, deterioro o
contaminación.
• Sirve para extender la muestra a través del hisopo en el medio
cultivo. Se suele comercializar ya estéril, listo para utilizar y
desechables.
80

5. PIPETAS
Se pueden disponer de forma individual o en
paquetes.
Pueden ser de vidrio, reutilizables por esterilización o
de plástico, generalmente desechables.
Pueden ser graduadas (con volúmenes específicos),
en cuyo caso su aspiración se realizará con
aspiradores para pipetas tipo pera o prepipeta,
pipetas Pasteur (no contienen volúmenes graduados),
muy utilizadas en bacteriología y cuya aspiración se
realiza con perillas de goma que no necesariamente
son estériles, aunque sí la pipeta, también nos
encontramos con micropipetas utilizadas para la
siembra de mililitros y microlitros en un determinado
medio de cultivo.
81

PREPARACIÓN DE INÓCULOS
• Un inoculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de
microorganismo problema.
– Se debe partir de un cultivo puro y
– De una concentración adecuada de microorganismo problema.
• Si la muestra no es pura se aplicarán distintos métodos para el
aislamiento mediante técnicas específicas:
– Siembra por estría en placa o por agotamiento,
– Utilizar medios de cultivo enriquecidos específicos y diferenciales que
permiten el crecimiento del tipo de microorganismo concreto que buscamos.
De esta forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser aislada
y desarrollada como cultivo puro.
82

PREPARACIÓN DE INÓCULOS
• Si el problema está en la
cantidad de
microorganismo, que no
es suficiente, será
necesario preparar un
inoculo con el fin de
obtener una cantidad
microbiana suficiente y
representativa para
obtener resultados fiables.
83

MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS
• Si la muestra es sólida o semisólida se tomará siempre con asa de siembra
estéril.
• Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipeta Pasteur
estéril en cantidad suficiente y, en ambos casos, se homogenizará
posteriormente en el medio específico de cultivo.
• Si la muestra tomada con asa de siembra estéril se adiciona a un medio
líquido se homogenizará y se dejará crecer a la temperatura adecuada,
que generalmente para microorganismos patógenos coincidirá con la
temperatura corporal, dejándolos crecer aproximadamente 24 horas.
• En ocasiones excepcionales se hace necesario la utilización de un
rotavapor para que el crecimiento se establezca por igual en todo el
medio líquido, aunque esto va a depender de su aplicación posterior y de
la cantidad de inoculo que se requiera.
84

• Si la muestra se toma con asa de
siembra estéril y se adiciona en un
medio de cultivo sólido se utilizarán
diferentes técnicas de siembra y
posteriormente se verificará el cultivo;
por ejemplo, siembra por agotamiento.
85

• Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta Pasteur y se adiciona a
un medio de cultivo líquido, se homogenizará la mezcla inicial por
agitación y se dejará crecer a una temperatura adecuada (unos 37 °C) en
un tiempo aproximado de 24 horas.
• Es importante que los inoculos sean siempre jóvenes y en ocasiones
excepcionales, sobre todo, si se necesita de mucha cantidad de inoculo, se
podría utilizar rotavapor.
86

• Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta Pasteur y ésta se
añade al medio sólido, posteriormente se extenderá con el asa de
Digrasky, previamente estéril a través de toda la placa incubándose a la
temperatura adecuada durante aproximadamente unas 24 horas. Se
requerirán también cultivos jóvenes.
• Los medios líquidos pueden ser agua destilada estéril, solución salina
estéril o, incluso, caldo de cultivo base. 87

• A veces es necesario partir de un inoculo con un número
aproximado de microorganismos problema.
• En estos casos, los inóculos se establecen en medios líquidos y el
número de microorganismos se recuenta de forma aproximada,
por comparación de medios líquidos con diferentes gradientes de
turbidez.
• Éste es el caso de la escala de Mac-Farland formada por una
batería de tubos cada uno de los cuales tiene distinta turbidez
según la concentración de cloruro de bario.
88

MÉTODOS DE INOCULACIÓN O SIEMBRA (MÉTODOS DE
AISLAMIENTO)
• El paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo, ya
sea líquido o sólido, se denomina siembra o inoculación.
• El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a
otro se denomina resiembra.
• Toda siembra, inoculación, o incluso resiembra, se puede
realizar de diferentes formas según las características de la
muestra, del medio en el que se van a sembrar o resembrar, del
tipo de material que se utilice, etc. A continuación, se explican
los métodos más importantes de siembra o inoculación.
89

SIEMBRA DEL INOCULO EN MEDIO LÍQUIDO
• Si se realiza con asa de siembra, ésta se carga con la muestra problema sólida o a
veces líquida en condiciones de esterilidad y se adiciona al medio líquido
agitándola.
• Si se realiza con pipeta se toma un volumen de muestra problema y se vierte al
medio de cultivo líquido agitándose hasta su homogeneízación.
• Si se realiza con escobillón o hisopo el método es igual que con el asa de siembra. 90

SIEMBRA DEL INOCULO EN MEDIO SOLIDO
Estas siembras pueden darse en placa o en tubo.
1. Siembra del inoculo en placa
Estas siembras pueden darse en placa o en tubo.
A.Técnica de Barry
B. Asa de Digrasky
C. Agotamiento por estría
D. Técnica de los cuatro cuadrantes
E. Técnica de los tres giros
91

Técnica de Barry
• Siembra previa al vertido del medio en la placa. Para ello en el medio de cultivo
previamente fundido (de 20 a 25 mililitros de medio a una temperatura de 45 a
50 °C) en tubo, se adicionará la cantidad de inóculo que oscila entre 0,1 a 0,4 y
se homogeniza la muestra en el tubo mediante el vibrador. Una vez, constituida
la muestra, se vierte ésta en la placa Petri estéril y se dejará solidificar. La
mezcla también se podría realizar en la misma placa Petri, aunque la
homogenización en este caso es más difícil. Esta técnica es utilizada, por
ejemplo, para la determinación del CMI (concentración mínima inhibitoria) de
un antibiótico frente a determinados microorganismos.
92

Asa de Digrasky
• Siembra de muestra líquida en placa con asa de Digrasky
• Consiste en adicionar al medio sólido un inoculo que puede oscilar
entre 0,2 y 1 mililitro según los casos con pipeta graduada estéril, y
posteriormente se extiende con el asa de Digrasky también estéril.
Esta técnica se suele utilizar para el recuento de viables,
antibiogramas, etc.
93

Siembra por agotamiento o
aislamiento en estría
Se tomará con el asa de siembra
(previamente esterilizado por
flameado) una cantidad adecuada de
muestra problema depositando el
inoculo en uno de los extremos
superiores de la placa; a partir de aquí
se realizarán movimientos en zig-zag
de un extremo a otro de la placa no
tomándose en ningún momento nuevo
inoculo y no levantándose el asa hasta
concluir la siembra de toda la placa.
94

Siembra por
agotamiento
Se tomará muestra problema con asa de siembra
previamente estéril y dicho inoculo se depositará en el
extremo superior de la placa, extendiéndose de un
extremo a otro de ésta, sólo en la parte superior.
Flameamos el asa de platino y giramos ligeramente
dicha placa repitiendo el proceso anterior que nos
permitirá arrastrar la muestra desde uno de los bordes
donde quedó la muestra hasta el otro extremo
superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el
asa de platino sin coger muestra como en el caso
anterior y siguiendo la misma dirección se repite la
operación hasta un total de 4 o 5 veces, que son las
que tienen cavida aproximadamente en una placa,
teniendo en cuenta que el último tramo se efectuará
hacia el interior de la misma.
95

Siembra por agotamiento
Aislamiento en estría múltiple. El resultado son colonias cada vez más
separadas como consecuencia de que cada vez se va arrastrando y separando
más la muestra. Es importante que para separar estas colonias se realice en
cada estría un flameado previo del asa de siembra.
96

Técnica de los cuatro cuadrantes
Con un rotulador, por ejemplo, para vidrio, en la base de la placa (reverso) se
dibujan dos líneas perpendiculares que deberán cruzarse en el centro de la
placa de tal forma que ésta quede dividida en 4 cuadrantes iguales. Se tomará
con el asa de siembra estéril una cantidad de inoculo y se adicionará en el
extremo superior de uno de los cuadrantes extendiéndose por todo ese
cuadrante en forma de zig-zag. Realizaremos la misma operación sin flamear
en todos los demás cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos
arrastrando el microorganismo problema, observándose en el último
cuadrante las colonias más aisladas o separadas.
97

Técnica de los 3 giros.
• Se rotula la placa de forma análoga al caso anterior. Se toma inoculo
con el asa de platino y se siembra por estría la mitad superior de la
placa. Sin flamear el asa de platino giraremos la placa unos 90° y
volveremos a sembrar una segunda vez. Así sucesivamente hasta
completar toda la siembra (girando de nuevo la placa 90°). Esta
técnica no es muy tilizada porque no permite buenos aislamientos.
98

Técnica de siembra por dilución
• Se dispondrá de una batería de tubo» con medio de cultivo específico o agua estéril según los casos.
• Se adicionará una cantidad de muestra sólida o líquida en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inoculo que
se añade en el tubo inicial.
• Se agitará hasta homogeneización.
• Con pipeta estéril se tomará una cantidad específica o exacta y se adicionará al segundo tubo, que se
homogeneiza. Repetimos la operación anterior con el tercer tubo y así sucesivamente hasta obtener la dilución
deseada. 99

Técnica de siembra por dilución
Con la dilución esperada, por ejemplo! 103
y 104
, inocular en placas de cultivo una cantidad
de inoculo exacto y extender con asa de Digrasky previamente estéril.
Incubar a temperatura precisa durante unas 24 horas y posteriormente recontar.
Existen muchas variaciones de este método. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo con
agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluyen hasta obtener la dilución
deseada; posteriormente son vertidos en placa y se deja solidificar.
100

Siembra del inoculo en tubo
• 1.Siembra por estría en tubos con medio sólido inclinado.
Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una
cantidad de muestra adecuada. Se añade al tubo desde el fondo de la
superficie de este, realizando movimientos ascendentes en zig-zag hasta
completar toda la superficie del medio. Este método es utilizado para
conservar cepas durante largos periodos, así como para la realización de
ciertas pruebas bioquímicas, como, por ejemplo, la prueba de la ureasa.
101

• 2.Siembra por picadura.
• Se suelen tomar con hilo de siembra
aunque en algunas ocasiones también
puede hacerse con asa de siembra.
Consiste en introducir el asa en el
medio de cultivo que se encuentra en
el tubo hasta el fondo de éste y en
posición central. Esta técnica se utiliza
para la siembra de medios de cultivo
semisólidos como por ejemplo, el
medio de oxidación fermentación de
Hugh-Leiffson.
102

.Siembra por picadura
• Se suelen tomar con hilo de
siembra aunque en algunas
ocasiones también puede hacerse
con asa de siembra. Consiste en
introducir el asa en el medio de
cultivo que se encuentra en el
tubo hasta el fondo de éste y en
posición central. Esta técnica se
utiliza para la siembra de medios
de cultivo semisólidos como por
ejemplo, el medio de oxidación
fermentación de Hugh-Leiffson.
103

• Consiste en la utilización de las dos técnicas
anteriormente descritas. Este método se lleva a
cabo cuando el medio es sólido y está inclinado.
Primero se realiza la siembra por picadura y
posteriormente la siembra por estría; son ejemplos
de este tipo de siembra la prueba en medio KIA y la
prueba en medio citrato, entre otras.
3. Siembra por picadura y estría.
104

CULTIVO DE CEPAS
• Aunque todo lo referente a cultivos se ha estudiado en el
tema correspondiente a cultivos, señalaremos aquí que tras la
preparación de un inóculo y posterior inoculación en el
adecuado medio de cultivo se requerirán una serie de
condiciones para que la siembra pueda desarrollarse y
realizar posteriormente los oportunos estudios cualitativos y
cuantitativos del microorganismo problema. Así pues, de
acuerdo con lo dicho, todo cultivo de cepas para poder crecer
como tal, requerirá de una serie de condiciones adecuadas,
que serán las siguientes:
105

METODO DE SIEMBRA EN PLACA POR
ESTRIA CULTIVOS PUROS
• Se esteriliza el asa y luego se extrae
con ella un inóculo del tubo.
• Se hace estrias en la placa
extendiendo los microorganismos.
• El asa se vuelve a esterilizar entre
distintas operaciones.
106

Cátedra de Micología
Mblgo. Juan Wilson Krugg
107

Preparacion de medios de cultivo

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