RT-PCR. Micromatrices. Polimorfismos. RFLPs. VNTRs. Genes. Inserciones Alu. SNPs. ADN mitocondrial.

1. CAPÍTULO 3. MARCADORES DE DETERMINACIÓN
DIRECTA
Técnicas
-Extracción y cuantificación de ADN.
-Enzimas de restricción.
-PCR.
-Secuenciación.
-RT-PCR.
-Micromatrices.
Polimorfismos
-RFLPs.
-VNTRs.
-Genes.
-Inserciones Alu.
-SNPs.
-ADN mitocondrial.
-Cromosoma Y
-VCNs.
-Genomas completos.

2. Marcadores de determinación directa
Los grandes avances que tuvieron lugar en las últimas décadas del siglo XX en
numerosas técnicas de Biología molecular y sobre todo en las que tienen que ver con
el análisis y la manipulación del ADN, abrieron las puertas a un nuevo tipo de
estudios de polimorfismos, ya no sobre los productos de los genes, sino directamente
sobre los genes mismos.
La gran cantidad de polimorfismos encontrados entre los productos de
expresión de los genes, como los grupos sanguíneos o las proteínas plasmáticas, es
superada ampliamente por la variación genética en las moléculas de ADN.
Hay una gran fracción del genoma que no aparece envuelta en la codificación
de proteínas. Se compone de fragmentos de ADN situados entre los genes, con
secuencias reguladoras, genes que han perdido su utilidad a lo largo de la evolución
y ya no son transcritos, etc. Las mutaciones en las regiones no codificantes del ADN
generalmente no producen un efecto fenotípico y se comportan como selectivamente
neutrales. Por ello, pueden acumularse una tras otra sin ser eliminadas por selección,
dando lugar a herramientas muy interesantes para estudiar la variabilidad y la
heterogeneidad entre los individuos y las poblaciones.
Desde el comienzo del Proyecto Genoma Humano, dedicado a la secuenciación de todo el ADN humano, se pudo
acceder al conocimiento de una gran variedad de polimorfismos, muchos de los cuales han sido o están siendo analizados en
diferentes poblaciones. En general, han revelado una enorme variabilidad que es transmitida según la herencia mendeliana.
Ha aparecido por tanto, un nuevo y vasto campo de investigación sobre marcadores genéticos.
La clasificación de los polimorfismos de ADN podría realizarse de acuerdo a diferentes criterios. Podrían por ejemplo,
desde el punto de vista funcional, dividirse entre ADN nuclear y ADN mitocondrial y dentro de cada grupo en ADN codificante
y no codificante. Además, las técnicas de análisis avanzan continuamente, por lo cual diferentes estudios sobre el mismo
fragmento de ADN no son siempre comparables. Por ello, primero se describirán las principales técnicas utilizadas para a
continuación enumerar los tipos de polimorfismos que han sido analizados con una cierta frecuencia.

3. Extracción de ADN
Puede obtenerse ADN de una gran cantidad de tejidos. Habitualmente se toman muestras de sangre total en tubo, de
manchas de sangre en papel, de células bucales, de pelos o de hueso.
Entre las varias técnicas disponibles, puede comenzarse con una solución tamponada de lisis (detergente y
proteinasa K). El detergente rompe las membranas celulares y nucleares y libera el ADN. La proteinasa K degrada las
histonas sobre las que se enrolla el ADN. Centrifugando a alta velocidad, precipitarán las proteinas y otros elementos de las
células, quedando el ADN en el sobrenadante.

4. Extracción de ADN
Una vez recuperado el ADN, puede añadirse una sal concentrada, con lo cual
se formarán agregados, que precipitarán al añadir etanol o isopropanol, ya que el
ADN no es soluble en alcohol. Centrifugando nuevamente, quedará un precipitado
de ADN. Entonces se puede eliminar el sobrenadante y disolver a la concentración
adecuada. Una técnica alternativa que obtiene mejores resultados, es la que se
basa en la aplicación de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico, aunque algunos de
los reactivos son altamente tóxicos.
Otra técnica alternativa se basa en Chelex, una resina quelante que atrapa los
iones de Magnesio, necesarios para la acción de las DNAsas. De este modo, el ADN
de la muestra no se degrada y puede ser almacenado durante un tiempo. En sentido
estricto no es una extracción, ya que no se depura el ADN.

5. Extracción de ADN
También pueden utilizarse diferentes kits
comerciales (basados en columnas de filtración,
partículas metálicas, etc.) e incluso puede
realizarse de forma automática.
El ADN se conserva a -20ºC al menos, o
mejor a -80ºC.

6. Cuantificación de ADN
Puede evaluarse la calidad del ADN extraído de dos formas:
1. Puede realizarse una electroforesis de agarosa con una pequeña parte de las muestras y valorar la intensidad de la
fluorescencia, lo que nos dará una idea aproximada de la concentración. Si aparece una estela de fluorescencia, sabremos
que el ADN se encuentra roto en fragmentos de diferentes tamaños.

7. Cuantificación de ADN
Fluorímetro
2. O bien, puede analizarse la pureza y concentración mediante un espectrofotómetro UV, que leerá la absorbancia a
260 y 280 nm, evaluando la proporción de ADN y proteínas de las muestras. Los ácidos nucleicos se revelan a 260 nm y
las proteínas a 280. Una unidad de absorbancia (OD) equivale a unos 50 µg/ml de ADN de doble cadena, 40 µg/ml de
ARN, 33 µg/ml de ADN de hebra sencilla y 30 µg/ml de oligos. La pureza se mide por la relación A260/A280 y debe ser
aproximadamente 1,8 para ADN y 2 para ARN.
Ambos métodos pueden considerarse complementarios.

8. Enzima Secuencia Enzima Secuencia
Eco RI GAATTC Nar I GGCGCC
Bcl I TGATCA Nae I GCCGGC
Nco I CCATGG Sma I CCCGGG
Bam HI GGATCC Acc III TCCGGA
Alu I AGCT Taq I TCGA
Hae III GGCC Mae II ACGT
Apa I GGGCCC Mae I CTAG
Not I GCGGCCGC Nde I CATATG
Bal I TGGCCA Ssp I AATATT
Hind III AAGCTT Spe I ACTAGT
Cfo I GCGC Swa I ATTTAAAT
Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción tienen como característica
principal que reconocen una determinada secuencia de
nucleótidos en el ADN y cortan la cadena por ese punto.
Algunas de las más de 100 conocidas en la actualidad
aparecen en el cuadro adjunto. Puede observarse que las
secuencias que reconocen son de una longitud variable,
normalmente entre 4 y 8 nucleótidos. También puede
apreciarse que en cada caso, la cadena complementaria es
idéntica si se lee en sentido contrario. Esto permite que las
cadenas cortadas puedan unirse de nuevo.

9. Enzimas de restricción
Esquema de un análisis básico con
enzimas de restricción
El uso clásico de las enzimas de restricción para el análisis de polimorfismos de ADN se esquematiza en la figura.
Básicamente, se trataba de cortar el ADN mediante las enzimas adecuadas. A continuación, se separaban los
fragmentos obtenidos mediante electroforesis. Después, se transferían a una membrana, donde quedaban fijados. En un
siguiente paso se hibridaban los fragmentos resultantes con una sonda complementaria de la secuencia que buscáramos,
marcada con radioactividad para poder visualizarla. Después de lavar, si la sonda seguía en la membrana por haberse fijado
al ADN, se vería en la autorradiografía.

10. Enzimas de restricción
Son los primeros análisis que se realizaron en
Genética forense.
Pero con estos resultados era virtualmente imposible
estimar las probabilidades de coincidencia, porque
generalmente se desconocía el origen de las bandas.
Además, este método consumía tradicionalmente
una gran cantidad de ADN.
En la actualidad, se aplican las enzimas sobre un
fragmento de ADN amplificado, optimizándose el
proceso y no se utilizan isótopos radioactivos para el
marcaje.
¿Cómo se amplifica el ADN?
Reacción en cadena de la polimerasa, en este capítulo

11. Enzimas de restricción
La existencia de una mutación en un lugar de restricción impedirá que la enzima corte por ese punto, de modo que puede
detectarse dicha mutación.
En esta figura se encuentra una mutación que define un nuevo genotipo. La banda que se obtiene en este caso es más larga
y por tanto más pesada, lo que se detecta al realizar la electroforesis.

12. Enzimas de restricción
Siguiendo con el ejemplo anterior, los homocigotos para la mutación tendrán una sola banda más pesada, los homocigotos
sin mutación tendrán las 2 bandas (intermedia y ligera) y los heterocigotos tendrán las 3 bandas.

13. Enzimas de restricción
Marcador
Marcador
Marcador
Marcador
Madre
Madre
Hijo
Hijo
Padre
alegado
Padre
alegado
Mix
Mix
¿Podría ser el padre en el gel de la izquierda? ¿Y en el gel de la derecha?
¿Cuál de los dos sospechosos podría ser el culpable?

14. Reacción en cadena de la polimerasa
La PCR se realiza en
termocicladores
La reacción en cadena de la polimerasa (en inglés Polymerase Chain
Reaction, PCR) es un método diseñado para amplificar ADN, de modo que se
obtienen una gran cantidad de copias del fragmento del genoma que se pretenda
estudiar. Merced a este proceso, la manipulación y el análisis del material hereditario
resultan mucho más sencillos y eficaces.
La enzima implicada es la Taq polimerasa, proveniente de Thermus aquaticus,
que tiene como particularidad ser efectiva a una elevada temperatura (72 ºC), de
modo que puede controlarse de un modo relativamente sencillo el tiempo durante el
cual está sintetizando nuevo ADN.
Esta técnica se realiza en un aparato denominado termociclador, que utiliza
una hebra de ADN como molde para sintetizar la cadena complementaria mediante
la Taq polimerasa, de un modo muy similar a como ocurre en la propia célula. El
termociclador somete a las muestras a una serie de cambios cíclicos de
temperatura, que facilitan cada uno de los procesos implicados en la replicación del
ADN.

15. Reacción en cadena de la polimerasa
Generalmente es preciso conocer la secuencia del
fragmento que se quiere amplificar o al menos dos
fragmentos que flanqueen la secuencia en ambos
extremos. Con esta información, se pueden diseñar y
sintetizar dos cebadores (o primers, oligonucleótidos de
no más de 30 nucleótidos de longitud) complementarios
de dos secuencias situadas a ambos extremos de la
cadena. Las secuencias se diseñan mediante
herramientas informáticas que permiten comprobar si son
secuencias únicas o se encuentran repetidas en otros
lugares del genoma. Los cebadores se unirán
específicamente a estas secuencias y le indicarán a la
enzima por dónde debe comenzar a copiar el ADN. Un
cebador actúa en sentido 3' y el otro en sentido 5'.
Como se observa en la figura, se obtienen algunas
cadenas de un tamaño mayor del esperado.
¿Cómo se diseña un par de cebadores?
Aplicación BLAST, práctica O1

16. Reacción en cadena de la polimerasa
Sin embargo, al cabo de varios ciclos, el número de cadenas indeseadas (línea azul) es mucho menor que el número de cadenas
adecuadas (línea roja).

17. Reacción en cadena de la polimerasa
En primer lugar, el ADN se desnaturaliza, es
decir, se calienta a unos 95-98 ºC, de modo que se
rompen los enlaces por puentes de hidrógeno que
unen ambas cadenas y se separan. A continuación
se baja la temperatura a entre 50 y 65ºC
(dependiendo de la secuencia del ADN y de los
cebadores), facilitándose la hibridación de los
cebadores con las cadenas de ADN.
Un nuevo calentamiento del medio, esta vez
hasta unos 72 ºC, permitirá que la Taq polimerasa
realice una copia de cada hebra en la que se haya
insertado un cebador. Repitiendo una serie de veces
este ciclo de temperaturas, se obtendrán un número
muy elevado de copias del fragmento de ADN
situado entre ambos cebadores. Una electroforesis
permitirá analizar el resultado de la amplificación.
La ventaja de esta técnica para el análisis de
diferentes polimorfismos estriba en que la cantidad
de ADN necesario para realizar la prueba es muy
pequeña, ya que se obtienen un gran número de
copias a partir de un reducido número de hebras y
la calidad del resultado de la electroforesis es
mucho mejor. En realidad, se pueden realizar
amplificaciones PCR a partir de una sola célula,
aunque el riesgo de contaminación de ADN foráneo
es entonces muy alto.
50-65ºC
72ºC

18. Secuenciación
Lectura manual de
una secuencia
El análisis más completo y directo del ADN es el análisis de la secuencia de bases nitrogenadas. Mediante la secuenciación
pueden detectarse absolutamente todas las variaciones que pueda haber en un fragmento del genoma. Además, puede analizarse
cualquier región, sea codificante o no.
Existen varias técnicas, entre las que destacan el método de los dideoxinucleótidos o de Sanger, que ha sido
tradicionalmente el más habitual. Se basa en la síntesis enzimática de ADN marcado mediante dideoxinucleótidos que terminan la
síntesis de la cadena. Actualmente, se usan cada vez más métodos de secuenciación masiva.

19. Secuenciación
El método de los dideoxinucleótidos se basa en
la existencia de cuatro tubos de reacción PCR. En
cada uno de ellos, una parte de una de las bases está
marcada. Así, un tubo tendrá dideoxiadenina, otro
dideoxicitosina, otro dideoxiguanina y otro
dideoxitimina. En la secuenciación automática, cada
uno de ellos además lleva adherido un fluorocromo
diferente.
Cuando en la síntesis de una nueva cadena por
la polimerasa se inserta un dideoxinucleótido, la
síntesis de esa cadena se detiene. Al finalizar los
ciclos PCR, en cada tubo habrá tantas cadenas de
longitud diferente como posiciones en las que se haya
podido insertar el dideoxinucleótido.

20. Secuenciación
Analizador de ADN
Aunque se comenzó realizando secuenciaciones manuales, ahora se utilizan los analizadores de ADN, popularmente llamados
secuenciadores automáticos.

21. Secuenciación
Analizador de ADN
En un secuenciador de capilaridad, las muestras se
desplazan desde el cátodo (1) hasta el ánodo (2) a
lo largo de un capilar (3) pasando a través del haz
de un láser (4). Hay una gradilla con muestras al
principio del recorrido (5) y un émbolo que inyecta
polímero entre cada muestra para limpiar y rellenar
el capilar (6).
1
2
3
4
5
6

22. Secuenciación
El resultado es un electroferograma como el de la figura.

23. Secuenciación NGS
En los últimos años se están desarrollando nuevos métodos, más eficaces para secuenciar el ADN. Se denominan
genéricamente como Next Generation Sequencing (NGS) methods.
En estos métodos se realizan simultáneamente una gran cantidad de amplificaciones PCR de pequeños fragmentos. Este
proceso puede darse o bien mediante una PCR en emulsión o una PCR puente.
En el primer caso (PCR en emulsión ), la mezcla de reacción consiste en una emulsión aceite-agua creada para encapsular
complejos con ADN y nanoesferas dentro de gotículas de agua. Tras la emulsión, se lleva a cabo la amplificación añadiendo los
reactivos adecuados, de tal manera que cada nanoesfera queda recubierta por varios miles de copias de la misma secuencia
molde.
Metzker, M. L. (2010). Nature reviews genetics, 11(1), 31-46.

24. Secuenciación NGS
En el segundo caso (PCR puente), la secuenciación tiene lugar en una placa de vidrio, sobre la que están fijados mediante
adaptadores específicos b) los cebadores y la polimerasa, c) los cebadores, d) las moléculas de ADN e) o bien la polimerasa.

25. Secuenciación NGS
Los fragmentos de ADN son entonces secuenciados simultáneamente. Después se reconstruye la secuencia completa a partir de
los solapamientos de las diferentes cadenas.

26. Secuenciación NGS
Uno de los métodos basados en emulsiones es la pirosecuenciación.
En el esquema de la izquierda se muestran los pocillos donde se
disponen los fragmentos de ADN unidos a microesferas, con el objeto
de facilitar el acceso de las enzimas implicadas.
En la pirosecuenciación se van añadiendo sucesivamente soluciones
de A, C, G y T. A medida que se polimeriza la nueva cadena un
conjunto de 3 enzimas (sulfurilasa, luciferasa y apirasa) transforma los
pirofosfatos liberados por la unión de un nucleótido en emisión de
fotones. Si se encuentran dos nucleótidos iguales seguidos, la
emisión en la ronda de ese dNTP será el doble.
La imagen que se obtiene se denomina flujograma.

27. Secuenciación NGS
Entre los ejemplos de soporte sólido, en la figura se observa el
método de los terminadores reversibles.
El ADN se encuentra fijado junto al cebador en la placa, con un
terminador reversible 3'-O-azidometil.
Se añade una solución de dNTPs, cada uno marcado con un
fluorocromo diferente.
Se lava para eliminar los sobrantes y se lee la emisión en cada punto
de la placa.
Entonces se regenera el grupo 3'-OH del terminador usando un
agente reductor y se repite el proceso.

28. Trabajo publicado en 2013 presentando la primera
amplificación y secuenciación del ADN mitocondrial de un resto
de 300.000 años, extraído de la Sima de los huesos, en
Atapuerca.
Meyer et al., 2013
Nature, 505(7483), 403-406.
Simulación de un análisis PCR:
Programa PCRprog.java, sección <software> de la
página de Antropogenética
Secuenciación NGS

29. PCR cuantitativa
La PCR cuantitativa o PCR a tiempo real es una modificación de la técnica original que permite conocer la existencia de
amplificación y el número de copias obtenidas conforme se desarrolla el proceso.
La PCR a tiempo real combina un termociclador, un espectrofotómetro y un ordenador.

30. PCR cuantitativa
El termociclador efectúa la PCR sobre unas muestras a las que añade un fluorocromo en cada amplificación si ésta se realiza. El
espectrofotómetro detecta la emisión del fluorocromo y lo transmite al ordenador.
Puede conocerse en qué pocillos ha habido amplificación y la intensidad de la misma.

31. PCR cuantitativa
PCR cuantitativa con Fusión de Alta
Resolución
(High Resolution Melt, HRM)
En la modalidad HRM, se ha añadido un fluorocromo que solo emite fluorescencia cuando se encuentra en una doble hebra de
ADN. Después de la amplificación, se desnaturaliza la muestra de ADN subiendo la temperatura gradualmente desde 55 hasta
95ºC. Cuando se separan las 2 hebras, deja de emitir fluorescencia. Pero la velocidad con que esto ocurre depende de la
secuencia de nucleótidos, de modo que una mutación alterará la curva de disminución de la fluorescencia.

32. Micromatrices
Las micromatrices son soportes de cristal,
silicio o plástico en las que se fijan miles de
sondas específicas de secuencia conocida.
Al poner una muestra amplificada PCR en
contacto con las sondas, aquellas cadenas
que tienen una secuencia complementaria
se hibridan. A continuación se eliminan
todas las cadenas que no se han unido
mediante lavados. Después se analiza la
imagen obtenida para obtener un patrón de
intensidades en cada casilla.

33. Micromatrices
También pueden fijarse los
fragmentos de ADN que se
pretende analizar y realizar una
miniPCR con dNTPs marcados.