Este documento describe una estrategia para construir vectores que codifiquen una secuencia líder de la cadena liviana kappa para generar anticuerpos monoclonales quiméricos anti-TNF-α humano. Se clonará la secuencia líder kappa en vectores pcDNA y pIgCH-16 para permitir la inserción posterior de la región variable del anticuerpo monoclonal murino anti-TNF-α. Esto permitirá expresar un anticuerpo quimérico de bajo costo para tratar la artritis reumatoide.

1. Construcción De VectoresConstrucción De Vectores
Para Generación DePara Generación De
Anticuerpos MonoclonalesAnticuerpos Monoclonales
Modificados Por IngenieríaModificados Por Ingeniería
GenéticaGenética
T.M. Antonio Serrano
Alumno Doctorado en Bioquímica
Fac. Cs Químicas y Farmacéuticas
Universidad de Chile

2. Los anticuerpos monoclonales
 Revolución Parda.
 Balas Mágicas
 Tecnología generada en
células fusionadas de
mieloma de ratón
 HAMA “human anti-
mouse antibodies” Köhler y Milstein

3. Köhler y
Milstein, 1975

4. Los monoclonales modificados
 Características deletéreas de los llamados anticuerpos
monoclonales de primera generación
 Acm murinos fueron modificados, originando moléculas
con mayor proporción de proteína humana en su
estructura, permitiendo que estos puedan ser utilizados
en inmunoterapias. Los llamados Anticuerpos
Monoclonales Modificados (AMM) aparecieron en
escena, en primer instancia como anticuerpos
quiméricos, luego los anticuerpos monoclonales
humanizados, y más recientemente los anticuerpos
monoclonales completamente humanos.
Gavilondo y Larrick, 2000; Brekke y Sandlie, 2003)

6. PRODUCTO TIPO BLANCO INDICACIÓN APROBACIÓN
Abciximab (ReoPro®
) Quimérico Receptor de la
coagulación GPIIb/IIIa
en plaquetas
Anti-trombótico en
pacientes sometidos
a angioplastía
1994
Rituximab (Rituxan®
) Quimérico Molécula CD20 en
linfocitos B
Linfoma de linfocitos B y
no Hodgkin
1997
Daclizumab (Zenapax®
) Humanizado Cadena α del receptor de
IL-2 en linfocitos T
activados
Rechazo agudo de
transplante renal.
Beneficios en
transplante cardíaco
1997
Basiliximab (Simulect®
) Quimérico Cadena α del receptor de
IL-2 en linfocitos T
activados
Rechazo agudo de
transplante renal.
Beneficios en
transplante cardíaco
1998
Palivizumab (Synagis®
) Humanizado Proteína F del virus
sincicial respiratorio
(RSV)
Infección por RSV en niños 1998
Trastuzumab (Herceptin®
) Humanizado Receptor del factor
crecimiento
HER2/neu
Cáncer de mama
avanzado
1998
Infliximab (Remicade®
) Quimérico Factor de necrosis tumoral Artritis reumatoide,
enfermedad de Crohn
1998
Gentuzumab (Mylotarg®
) Humanizado Molécula CD33 en
progenitores
mieloides
Leucemia mieloide aguda
refractaria y
recidivante
2000
Alemtuzumab (Campath-1H®
) Humanizado Molécula CD52 en
linfocitos y monocitos
Linfoma y leucemia crónica
de linfocitos B
2001
Adalimumab (Humira®
) Completamente
humano
Factor de necrosis tumoral Artritis reumatoide 2003
Aguillón, 2005

7.  En los anticuerpos quiméricos, los dominios variables antígeno-
específico, tanto de las cadenas livianas como de las cadenas
pesadas de la molécula de inmunoglobulina (Ig), son codificados
por genes de origen murino, mientras los dominios constantes
corresponden al producto de genes de origen humano.

 Estas tecnologías permitieron que a fines de la década pasada
se realizasen numerosos ensayos clínicos investigando la eficacia
de los diversos anticuerpos quiméricos, con usos clínicos definidos
en el área de la oncología, reumatología y cardiología, por solo
nombrar algunos. Cada día aumentan los posibles blancos
moleculares de las patologías, augurando un promisorio campo de
aplicaciones e innovación en el área de los AMM.

8. La artritis reumatoide (AR)
 Es una enfermedad sistémica auto-inmune heterogénea con un amplio
espectro de severidad clínica, que afecta a cerca del 1% de la población
chilena, según el Ministerio de Salud, que la declaró como una de las
enfermedades prioritarias del la política de Salud Pública. Se caracteriza
por inflamación crónica, dolorosa y progresiva de la membrana sinovial de
las articulaciones, conduciendo normalmente a una significativa
incapacidad por destrucción del cartílago y hueso articular, afectando
dramáticamente la calidad de vida. Es una enfermedad que va desde la
artritis leve hasta una forma invalidante que se caracteriza por tener altos
títulos de factor reumatoide y compromiso vital de otros órganos (Wicks et
al, 1994). La etiología y la patogénesis de la enfermedad son complejas y
no han sido completamente dilucidadas (Pincus et al., 1994; Breedveld
1998).Sin embargo se conoce que la sobre-expresión de TNF e IL-1
parecerían ser vitales, tanto en el proceso inflamatorio como en la ejecución
del daño articular (Brennan et al., 1992; Smolen y Steiner, 2003).

9. El TNF
 El TNF, liberado principalmente por los macrófagos activados,
promueve la síntesis de otras citoquinas pro-inflamatorias; estimula a las células
endoteliales a expresar moléculas de adhesión que atraen a los leucocitos a las
articulaciones afectadas; acelera la producción de metaloproteinasas por los
macrófagos sinoviales, fibroblastos, osteoclastos y condrocitos, las cuales degradan
la matriz extracelular. Además, TNF suprime la síntesis de proteoglicanos del
cartílago (Choy y Panayi, 2001). Debido a las múltiples acciones mencionadas, es
que a TNF se le atribuye un papel más preponderante en la patogénesis de la AR
que el atribuido a otras citoquinas tales como IL-1. (Macnaul KL et al 1990)
 En la actualidad existen AMM contra TNF-α disponibles en el comercio
internacional (Elliot MJ et al 1993). Entre estos destaca infliximab y adalimumab,
(Glennie MJ et al 2000)
 los cuales han arrojado excelentes resultados en la disminución de los síntomas y la
progresión de la AR, presentando ventajas terapéuticas frente a drogas
convencionales. Sin embargo, el costo actual de estos anticuerpos, hace casi
imposible el uso de estas terapias en Chile. (Aguillón JC, et al 2003)

10. La estrategia
 Hace algún tiempo en el Programa de Inmunología de la
Facultad de Medicina de la Universidad de Chile se
desarrolló el hibridoma G9, el cual es capaz de producir
un anticuerpo monoclonal murino contra Factor de
Necrosis Tumoral alfa (TNF-α) humano. (Aguirre A et al
2003)
 En base a este anticuerpo monoclonal, se propuso
desarrollar un anticuerpo Químerico anti TNF-α humano,
en donde sólo las regiones variables de las cadenas
pesadas y livianas de la inmunoglobulina serian de
origen murino, mientras que las porciones constantes de
ambas cadenas son de origen humano.

11. La estrategia
 Esquema de la estrategia a utilizar para el clonamiento de los
segmentos de una inmunoglobulina quimérica. Las cadenas
liviana y pesada de la inmunoglobulina son clonadas en
vectores de expresión diferentes, los cuales poseen los
segmentos constantes de origen humano (CH y CL) y solo la
región variable de origen murino de ambas cadenas (VH y VL).
Ambos vectores poseen genes de resistencia (R) a
antibióticos diferentes, que permitan la co-transfeccion y
selección de una línea celular productora de anticuerpos.

12.  El método a utilizar se inicia con una amplificación de las secuencias de
DNA correspondientes a los genes que codifican las cadenas polipeptídicas
constantes CH y CL de Inmunoglobulinas humanas, mediante la técnica de
PCR. Paralelamente también se obtienen las secuencias líder de las
cadenas H y L, necesarias para su expresión en los sistemas eucariontes
de producción de inmunoglobulinas. Esto genera sitios de restricción entre
ambos insertos de DNA, lo cual permitirá el subclonamiento de las
secuencias DNA codificantes de las regiones variables de las cadenas H
(VH) y L (VL).
 Para la elección de vectores de clonamiento de los genes constantes
de cadena H y L de Igs, es importante tener en cuenta que deben tener
diferentes genes de resistencia a antibióticos para células eucariontes, que
permitan un co-transfección. En este sentido, existen diversos vectores que
cumplen con este requisito, entre éstos pcDNA3.1 (Invitrogen, USA). Por
otro lado, para clonar el gen que codifica la cadena L, se obtendrá del
vector pSecTag (Invitrogen, USA) el cual tiene la secuencia líder de la
cadena L tipo κ.

13. Objetivos
 OBJETIVOS
 En nuestro laboratorio se ha clonado el gen que codifica la porción constante de la
inmunoglobulina G a partir de DNA de leucocitos de sangre periférica humana, en un vector
pcDNA3.1, el cual se nombró como pIgCH-16. De acuerdo a la estrategia, como resultado
intermediario, se requiere insertar en el mismo plásmido la porción líder de la cadena kappa,
para de esta forma permitir, en un sitio de clonamiento específico entre ambas regiones, la
inserción de la porción variable de la inmunoglobulina anti TNF murina, u otras porciones de
otros anticuerpos que se pudiesen quimerizar en el futuro
 Además se pretende clonar en otro vector la cadena kappa solamente, de esta forma se
pudiese insertar otras cadenas constantes de otros isotipos de inmunoglobulinas como IgA o
IgE, de interés en variadas aplicaciones en medicina.
 Objetivo general
 Construir vectores plasmidiales que codifiquen la secuencia líder de la cadena liviana Kappa.
 Objetivos específicos
 .
 Obtención de Cadena líder Kappa a partir del vector pSecTag.
 Ligación de secuencia líder en vector pcDNA y pcCH-16
 Secuenciación

14. Mat y met
 MATERIALES Y MÉTODOS
 Miniprep de purificación de plásmidos: De cultivos de bacterias se tomaron 3 ml y se concentraron en un tubo Eppendorf, centrifugando a 5000 rpm por 1 minuto. Se
utilizó un Kit para purificación de plásmidos (Qiagen, Germany), según instrucciones del fabricante. Se obtuvieron 50 ul finales de vector purificado, que fueron
almacenados a -20ºC para su posterior cuantificación.
 Cuantificación de plásmido: Se realizó una digestión con la enzima de restricción EcoRI (BioLabs U.K) a partir de 0,5 μl de plásmido purificado, durante 37ºC por 2 horas,
para luego calcular la concentración del DNA utilizando un marcador de bajo peso molecular (Invitrogen, USA), en una electroforesis gel de agarosa al 1%. La cantidad
de plásmido cargado fue determinada en relación al marcador de tamaño de DNA Lambda/Hind III (Winkler, Chile)
 Reacción en cadena de la Polimerasa para cadena líder Igk : Se ordenó la síntesis de una pareja de partidores. LidpSecF: AAAAGCGGCCGCCACCATGGAGACAGA y
el partidor complementario: LidpSecR: TTTTCGCCGGCGGTGGTACCTCTGTCT. (Alpha Labs, USA) Se utilizaron 5 unidades de Taq polimerasa (Promega, USA), 10
pmoles de cada uno de los partidores. En un termociclador (ThermoCycler Gradient, Thermo USA) se realizó denaturación por 2 minutos a 72ºC y 30 ciclos de: 1 minuto
de denaturacion a 94ºC, 30 segundos de alineamiento en gradiente de temperatura ,desde 45 a 55 ºC y 30 seg de elongación a 72ºC, para terminar con una elongación
final de 10 minutos a 72ºC. El producto de la reacción fue evaluado en gel de agarosa al 3 %, se cuantificó con respecto al marcador de tamaño de DNA 25 pb (Winkler,
Chile), utilizando densitometría de bandas mediante el software Scion Image.
 Precipitación de productos de PCR: Se realizaron 10 reacciones de PCR, las cuales fueron mezcladas y concentradas en secadora Speed Vac (Perkin Elmer, USA) por
15 minutos a intensidad media hasta un volumen de 80 μl. Se agregó 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M y dos volúmenes de etanol absoluto frío, más 0,5 μl de
glicógeno 5 ng/μl, precipitando por 30 min a –80ºC. Luego se centrifugó a 13.000 rpm a 4 ºC por media hora. Se retiró el sobrenadante con pipeta y el pellet se dejo secar
a temperatura ambiente. Luego se agregaron 500 μl de etanol al 75% centrifugando por 2 minutos a 13.000. Se evaporó todo el etanol en baño a 37ºC, y se resuspendió
en 20 μl de agua ultra pura. Se cuantificó el proceso de precipitación en un gel al 3% agarosa.
 Digestión con Enzimas de Restricción Not I y EcoRI: El vector de clonamiento pcDNA3.1(-), el plásmido pIgCH-16, que contiene la región constante de la cadena liviana
de la IgG1 humana y el fragmento que contiene la secuencia Líder de cadena Kappa, fueron cortados en reacciones independientes con las enzimas de restricción Not I (
Promega, USA )y EcoRI (BioLabs, UK) que en presencia de Buffer O (Promega, USA) en un volumen total de reacción de 25 μl por 2 horas a 37ºC. Luego para el
fragmento Lider Igk se realizó electroforesis en gel de agarosa al 3 % por 1 hora a 80 v. Mediante un bisturí fueron cortados los segmentos del gel que contenían los
fragmentos de interés visualizados por luz UV, para luego mediante congelación y descongelación de la agarosa puesta en un trozo de parafilm, tomar con pipeta el
eluído líquido del gel al descongelarlo con la presión de los dedos. Los productos de digestión plasmidiales fueron cuantificados en gel de agarosa al 1%. En el caso de la
purificación de fragmentos digeridos por electroforesis de los vectores, se realizó purificación del segmento mediante un kit para dichos fines. (Qiagen, Germany).
 Reacción de Ligación: Después de la doble digestión con enzimas de restricción y su posterior cuantificación, el fragmento Líder Igk y los vectores de clonamiento, fueron
incubados en una relación molar 1:3 vector: inserto. En una reacción se utilizó Enzima T4 ligasa según las indicaciones del fabricante (Biolabs, UK).
 Transformación de bacterias competentes: A la reacción resultante de la ligación fue agregada una alícuota de bacterias Escherichia coli DH5α previamente
descongeladas, se incubó por 30 min en hielo. Luego se indujo transformación a 42ºC por 1,5 min y se enfrió e hielo por 2 min. Luego se agrega 1 ml de SOC, se mezcla
y se incuba a 37 por 1 hora. Luego en placas Petri preparadas con agar LB con 200 ug/ml de ampicilina sólido fueron sembrados 100 μl de la transformación. Se crecen
colonias por 24 horas, se seleccionaron algunas y se subcultivó expandiéndolas en nueva placa. Se realiza una PCR con los partidores LidpSecF y LidpSecR para
verificar inserto en colonias. Una detección positiva determinó la amplificación del vector en crecimiento en medio LB líquido. Se realizó purificación y cuantificación de
los vectores.
 Secuenciación: Se enviaron 500 ng de plásmidos seleccionados al servicio de secuenciación automática del departamento de Ecología de la Facultad de Ciencias
Biológicas de la Universidad Católica, para corroborar que los productos amplificados correspondan a un marco de lectura abierto que dé origen a la secuencia esperado.
Las secuencias obtenidas fueron analizadas y alineadas en el programa Vector NTI8.

18. Resultados
 881
 LidpSecF ......AAAA GCGGCC..GC CACCATGGAG
ACAGA..... ..........
 LidpSecRC .......... ..................... .......... .......... pSecTag
 GGAGACCCAA GCTGGCTAGC CACCATGGAG
ACAGACACAC TCCTGCTATG
 931
 LidpSecF .......... ..................... .......... ..........
 LidpSecRC .......... .......... ..GGTTCCAC TGGTGACGAA
TTCCCCC...
 pSecTag GGTACTGCTG CTCTGGGTTC CAGGTTCCAC
TGGTGACGCG GCCCAGCCGG
 Alineamiento de los partidores
LidpSec F (amarillo) y R
(celeste) para la región líder
Igk del vector pSsec Tag 2B.
Los partidores diseñados
portan en su secuencia zonas
de corte (negrita) para las
enzimas de restricción Not I y
EcoRI para F y R
respectivamente, lo que
amplificó fragmentos de 77-80
pb en una reacción en cadena
de la polimerasa (PCR)

19.  Determinación Temperatura Óptima de
Alineamiento para Reacción en Cadena
de la Polimerasa. ( PCR) El cálculo
teórico de la temperatura de alineamiento
por parte del programa Vector NTI8
sugirió una temperatura de alineamiento
teórica de 50º C para los partidores.
 Se determinó en termociclador de
gradiente de temperatura de alineamiento
donde se obtenía mayor eficiencia de
amplificación de producto de PCR., Si
bien en rangos de temperatura de +/- 5ºC
con respecto a la temperatura optima
obtenida no se producen grandes
diferencias de cantidad de producto, se
consideró la mayor densidad de señal,
mediante densitometría de bandas.
 La temperatura de alineamiento que otorga
mayor producto de PCR de los partidores
Lidpsec es a 50ºC. Fotografía de gel de
acrilamida a al 8% cargado con los
productos de una gradiente de temperatura
de alineamiento de los partidores Lidpsec F
y R para cadena Líder de Igk de la
inmunoglobulinas humanas utilizando como
templado el plasmido pSsec Tag 2B. Se
utilizó como estándar un marcador de peso
de 25 pb.

20.  Cuantificación fragmento pre
ligación: La secuencia líder de Igk
obtenida de la PCR de el plásmido
pSecTag, fue precipitada,
resuspendida y digerida con las
enzimas de restricción EcoRI y Not
I, para luego realizar electroforesis
que permita la eliminación de los
segmentos cortados. Se purificó el
fragmento a partir del trozo de gel
de agarosa al 3%, para luego
cuantificar nuevamente previo a la
reacción de ligación.
 Por otro lado los vectores de
expresión pcDNA3.1(-) y pIgCH-16
fueron digeridos, purificados y
cuantificados en un gel del agarosa
al 1%.
 Cuantificacion de fragmento líder Igk y
vectores pcDNA y pIgCH-16 pre
ligación. En un gel de agarosa al 3% el
fragmento líder Igk se cuantificó según
el marcador de peso molecular de 100
pb (A). Utlizando el marcador Lambda
Hind III como estándar molecular,
pcDNA y pIgCH-16 fueron
cuantificados previos a la ligación.
pIgCH-16 posee una masa mayor
pues es un pcDNA que porta la
porción constante de las cadena
liviana de la IgG.(B)

21.  Screening de Colonias Transformadas
post Ligación por PCR: Producto de la
ligación de los vectores y el fragmento
Igk, se realizó transformación de
bacterias E. coli DH5α competentes. Se
efectuó el plaqueo de colonias en medio
de selección sólido con ampicilina.
Posteriores se aisló colonias con las que
se realizó un PCR de colonias. Para ello
se tomó una pequeña de bacterias y se
agrego directamente a la reacción de
PCR en base a los partidores LidpSecF y
LidpSecR. De esta forma se seleccionó y
verificó que clones presentaban el
plasmidio que contenían el fragmento
líder Igk.
 Según los resultados, se seleccionó
los clones pcDNA2, pcDNA4, pIgCH16-3
y pIgCH16-4, los cuales portan la
secuencia líder Igk para su posterior
crecimiento en medio de cultivo líquido y
posterior cuantificación.
 PCR de selección de colonias
transformadas con vectores que porten el
inserto Igk. Fotografía de una electroforesis
de productos de PCR de 5 colonias
transformadas con el vector pcDNA y 5
colonias de bacterias transformadas con el
vector pIgCH-16.

22.  Cuantificación vectores
clonados previo secuenciación:
Una vez crecidos las colonias
seleccionadas mediante PCR,
se procedió a una purificación
de plásmido para su posterior
cuantificación previa al envío al
servicio de secuenciación
automática.
 Según las estimaciones de
cantidad de DNA obtenido del
plásmido pcDNA2 no cumplía la
cantidad mínima requerida para
la secuenciación automática por
lo que se descartó.
 Cuantificacion de vectores
clonados previos a secuenciación
Fotografía de una electroforesis
de plásmidos que portan la
secuencia lider Igk, con respecto a
marcador de peso molecular y al
vector original pcDNA.

23.  Secuenciación: Se enviaron 500 ng de
plásmido al servicio de secuenciación, el
cual permitió realizar un alineamiento
revelando que los 3 vectores presentan
el inserto de cadena líder de Igk,
demostrado por la secuencia Kozak y el
triplete de iniciación ATG (Kozak, 2002).
 Alineamiento de de cadena Líder Igk, y
vectores pcDNA4, pIgCH3 y pIgch4. La
secuenciación reveló que la cadena
kappa proveniente del vector pSecTag
2B se encuentra presente en los 3
vectores analizados
 90
Kappa GCTGGCTAGC CACCATGGAG
ACAGACACAC TCCTGCTATG
GGTACTGCTG PCDNA-4 GCGGCC..GC
CACCATGGAG ACAGACACAC
TCCTGCTATG GGTACTGCTG PIGCH3
GCGGCC..GC CACCATGGAG
ACAGACACAC TCCTGCTATG
GGTACTGCTG PIGCH4 GCGGCC..GC
CACCATGGAG ACAGACACAC
TCCTGCTATG GGTACTGCTG 140
Kappa
CTCTGGGTTC CAGGTTCCAC
TGGTGACGCG GCCCAGCCGG
CCAGGCGCGC PCDNA-4 CTCTGGGTTC
CAGGTTCCAC TGGTGAC...
.CGAATTCCA CCA....... PIGCH3
CTCTGGGTTC CAGGTTCCAC
TGGTGAC... ..GAATTCAA GGGC.CCATC
PIGCH4 CTCTGGGTTC CAGGTTCCAC
TGGTGAC... ..GAATTCAA GGGC.CCATC

24.  DISCUSIÓN
 Mediante esta Unidad de
Investigación se pudo construir tres
vectores de expresión que portan en su
estructura el gen que codifica para la
cadena líder de iniciación de la trascripción
de la cadena liviana kappa de las
inmunoglobulinas humanas: pIgCh-3 y 4
que además poseen la cadena constante
(CL) dejando entre ambos sitios de
inserción para la ingeniería de fragmentos
de la cadena variable de la inmunoglobulina
anti TNF murina. Este vector permite
además dejar la puerta abierta para que se
inserten otras cadenas variables de interés
en el futuro para otras aplicaciones en bio
medicina. También se genero un vector
pcDNA-4, que sólo porta la cadena líder
kappa, lo que permite insertar cadenas
pesadas de otras clases de
inmunoglobulinas como E o A para otras
aplicaciones, por ejemplo en inmunología
de mucosas.

25.  Ya logrado este objetivo intermedio, continúa el paso de amplificar el segmento variable de la inmunoglobulina
anti-TNF murina. Se amplifica la secuencia de codifica para este fragmento mediante PCR, y luego se procede a
realizar la ingeniería para la inserción en los vectores pIgCH-3 o 4, para luego corroborar y secuenciar la
inserción.
 Paralelamente a este trabajo en nuestro laboratorio se trabaja para la construcción del segundo vector
que codifica para la porción pesada de la inmunoglobulina. Una vez seleccionados ambos vectores, se
transfectarán, por electroporación o lipofección a células Cos-7 o CHO (Sanna, 2002; Andersen y Krummen,
2002). Las células transfectadas o transfectomas se seleccionarán por su resistencia a antibiótico y la secreción
de la proteína al medio. Se verificará la incorporación del DNA por PCR y la expresión del RNA mensajero por
RT-PCR. La secreción de la proteína se realizará por ELISA sándwich, utilizando anticuerpos anti-cadena H o L
de Igs humanas para capturar la proteína, mientras otro anticuerpo anti-cadena H ó L, conjugado a peroxidasa,
servirá para la detección.
 Con la finalidad de verificar que la secuencia de los insertos de DNA clonados correspondan a las
regiones variables de Igs de ratón, éstos serán secuenciados, solicitando el servicio a un laboratorio externo. Las
secuencias nucleotídicas obtenidas serán analizadas, haciendo uso de programas computacionales que
permitan determinar su homología con otras secuencia de Igs reportadas en la literatura (Ej. GeneBank). Se
utilizará las secuencias nucleotídicas con el fin deducir la secuencias aminoacídicas y clasificar las regiones
variables, según los subgrupos existentes, utilizando bases de datos alternativas (Johnson y Wu, 2001).
 De esta forma se avanza en la implementación de la tecnología de modificación y producción de AMM,
aplicable al desarrollo de otras moléculas de importancia económica y social, Como sub-productos
biotecnológicos, se han generado productos intermedios patentables vectores de DNA con genes constantes de
las cadenas pesadas y livianas de inmunoglobulinas humanas, con sitios de clonamiento para genes variables
murinos, que permitirán quimerizar o humanizar otros Acm. De esta forma nos acercamos a que un tratamiento
de última generación esté disponible a un porcentaje de nuestra población que sufre artritis reumatoide,
contribuyendo así a mejorar su calidad de vida.

26.  BIBLIOGRAFÍA
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