La prueba de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una técnica que permite amplificar un fragmento de ADN de manera exponencial a través de ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento. Esto permite identificar virus, bacterias u otras secuencias de ADN con alta precisión a partir de una mínima cantidad original. El proceso involucra la desnaturalización del ADN, la unión de cebadores y la elongación de las cadenas de ADN nuevas a través de la acción de una ADN polimerasa termoest

1. BENEMÉRITA UNIVERSIDAD
AUTÓNOMA DE PUEBLA
Laboratorio de
Microbiología y Virología
Prueba de “PCR”
Mariana Paz Rossainz Cruz

2. ¡Que es la Prueba de PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por
sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica
de biología molecular,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de
copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo;
en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original,
o molde.
Sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la
amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta
probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad,
identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica
sobre el ADN amplificado

3. Fundamento
Esta técnica se fundamenta en la propiedad
natural de los ADN polimerasas para
replicar hebras de ADN, para lo cual se
emplean ciclos de altas y
bajas temperaturas alternadas para
separar las hebras de ADN recién formadas
entre sí tras cada fase de replicación y, a
continuación, dejar que las hebras de ADN
vuelvan a unirse para poder duplicarlas
nuevamente
Inicialmente la técnica era lenta, ya que las
polimerasas se desnaturalizaban al realizar
los cambios de temperatura y era necesario
agregar nuevas polimerasas en cada ciclo.
Las temperaturas del ciclo (95 C en las fases
de desnaturalización del ADN) suponen la
inmediata desnaturalización de toda
proteína, se emplean ADN polimerasas
termoestables, extraídas de
microorganismos adaptados a vivir a esas
temperaturas, restrictivas para la mayoría
de los seres vivos. como: Thermus
aquaticus (polimerasa Taq),
Thermus aquaticus

4. Hoy, todo el proceso de la PCR está
automatizado mediante un aparato
llamado termociclador, que permite calentar
y enfriar los tubos de reacción para
controlar la temperatura simplemente
invirtiendo la corriente eléctrica. Necesaria
para cada etapa de la reacción.
Los tubos usados para PCR tienen una
pared muy fina, lo que favorece una
buena conductividad térmica,
permitiendo que se alcance rápidamente
el equilibrio térmico. Casi todos los
termocicladores calienta la tapa de cierre
con el fin de evitar
la condensación sobre los tubos de
reacción

5. Optimización
La PCR es una técnica de gran sensibilidad, necesita una mínima cantidad de ADN para obtener un gran
número de copias. Además, puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones
inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la amplificación de ADN no correspondiente a la muestra
a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas).
Se han de tomar una serie de precauciones para evitar la contaminación con ADN extraño. Ejemplos en
los que es especialmente importante la amplificación son la detección de enfermedades o el diagnóstico
de identidad y parentesco. Posibles precauciones son:
*Tener especial cuidado durante los pasos previos a la amplificación: recogida, envío, custodia y procesado
de muestras.
*Limpieza exhaustiva y esterilización (lejía, etanol, luz UV) de la superficie de trabajo entre la realización de
una PCR y la siguiente.
*En laboratorios de diagnóstico genético, se suelen tener áreas separadas de trabajo: un laboratorio para la
preparación de la mezcla madre para la PCR, otro para la adición del ADN a amplificar, otro donde se
encuentra la maquinaria para realizar la PCR y otro donde se abre y analiza la muestra ya
amplificada.
*Cabinas de seguridad biológica para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades.
*Protección adecuada de los operarios que manipulen las muestras y los instrumentos del laboratorio:
guantes, bata, botas, gafas de seguridad, pelo recogido... En el diagnóstico molecular es conveniente
que se cambien estos elementos al pasar de una zona de trabajo a otra.

6. Ciclo de Amplificación
El proceso de PCR por lo general consiste
en una serie de 20 a 35 cambios
repetidos de temperatura llamados
ciclos de 2-3 pasos a diferentes
temperaturas.
Los pasos de ciclos a menudo están
precedidos por un choque térmico
(llamado "hold") a alta temperatura
(> 90 C), y seguido por otro hold al
final del proceso para la extensión de
producto final o el breve almacenaje.
Dependen de gran variedad de
parámetros: como la enzima usada
para la síntesis de ADN (la
polimerasa Taq, la temperatura de
máxima actividad está en 7580 °C ), la concentración de iones
divalentes y de los dNTP en la
reacción, y la temperatura de unión
de los cebadores, así como la longitud
del ADN que se desea amplificar

7. Pasos en el ciclo de
amplificación
Inicio
Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 C (ó 98 C con una
polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Necesario
para ADN polimerasas que requieran activación por calor.
Desnaturalización
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas del ADN). Este paso
puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra la
forma más habitual. La temperatura que se meplea para la desnaturalización depende
de la proporción de G+C que tenga la cadena, como el largo de la misma. Otros métodos,
raramente empleados son la adición de sales o agentes químicos para la desnaturalización.
Alineamiento o unión del cebador
A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su
secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a
40-68 C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los
puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman
cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La
polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN.
Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.

8. Cebador
ADN
Polimerasa

9. Extensión o elongación de la cadena
Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria
y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La
polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde
añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de
los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se
extiende). La temperatura para este paso depende de el ADN polimerasa que usemos
Elongación final
Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos
tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple
restante sea totalmente ampliado.
Conservación
Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la
reacción a corto plazo.
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN, se emplean técnicas
de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es,
longitud y en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamaño: típicamente
se emplean en gel de agarosa para fragmentos grandes; en acrilamida para los más pequeños; y
más rápida y aplicable a PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.