Estructura cristalina del dominio n quinasa de la gne acetil-manosa-amina

1. Docente: MsC QF. ANGELICA MINAYA
INTEGRANTES:
 CONTRERAS CASTAÑEDA, NANCY
 SALINAS PARDO, JESSICA
 GERRA CHUQUILLANQUI, JESSICA
 VASQUEZ CIEZA, MARITZA
 GONSALES CUADROS, ANAMELVA
 PONCE ISIDRO , ELIZABETH
 TERESA

3. ÁCIDO SIÁLICO
El ácido siálico o ácido N-acetilneuramínico es un
monosacárido acido derivado del ácido neuramínico
(un compuesto base de 9 átomos de carbono)
mediante acetilación.
El ácido siálico está
presente en los
gangliósidos
Se encuentra en la
membrana
plasmática de las
células de los
ganglios del SNC

4. BIOSÍNTESIS DEL ÁCIDO
SIÁLICO
Uridina difosfato Ácido N-
N- acetilneuramínic
acetilglucosamina o

5.  Se sintetiza mediante la epimerización de la UDP-
N-acetilglucosamina en N-acetilgalactosamina, que
acaba dando lugar a N-acetilmanosamina-6-
fosfato. Esta última reacción es catalizada por la
enzima UDP-GlcNAc 2-epimerasa/ManNAc 6-
quinasa (GNE).

6. UDP-GlcNAc 2-epimerasa/N-acetilmanosamina quinasa
ENZIMA BIFUNCIONAL IMPORTANTE PARA
LA FORMACIÓN DEL ÁCIDO SIÁLICO
GNE: Tiene 2 dominios Dominio C-
Dominio N-
terminal de terminal
epimerasa quinasa
Participa en la
EPIMERASA síntesis del ácido Enzima que
siálico utiliza ATP
Es una enzima que
convierte una
molécula en otro.

7. DOMINIO
convierte UDP- GlcNAc a N-
EPIMERASA acetylmannosamine
(ManNAc)
Fosforilado en
posición 6
Al grupo
DOMINIO
ROK QUINASA
(Represor, pertenece
ORF, la
quinasa)
Conjunto de
proteínas
bacterianas

8. BIOSÍNTESIS
DEL ÁCIDO
SIÁLICO
Forma activa
de Neu5Ac
Citidina –
monofosfato de
acido n- acetil –
(CMP –Neu5Ac)

9. Responsable
de la formación
Isoforma 1 básica de los
ácidos siálicos
Tres isoformas de
proteínas GNE
Se han
Isoformas 2 y 3 reducido las
Para uso actividades de
humano epimerasa
Puede ajustar la Pero las actividades
producción de quinasa permanecen casi
ácidos siálicos intactas

11. CLONACION DE ADN
La clonación del ADN puede definirse como la
recombinación in vitro de un fragmento de
ADN con un vector de ADN con capacidad de
replicación.El fragmento de ADN se
replicará junto con el vector de ADN en la
célula hospedadora y así será posible obtenerlo
en un número elevado de copias.

12. CLONACION DE ADN

13. OBTENCIÓN DEL ADN
El ADN podrá obtenerse mediante la
extracción a partir de la célula, generalmente con
la finalidad de construir una genoteca.
Básicamente consiste en una lisis
celular y la purificación del ADN,con la
finalidad de que este resulte libre de
contaminantes. Luego cromatografía y
cristalografía

14. FRAGMENTACIÓN DEL ADN
Las endonucleasas son enzimas
que tienen como función
reconocer y cortar el ADN
foráneo. El ADN de la célula no
se corta y esto es porque la
secuencia que reconocería la
enzima se encuentra metilada y
por tanto no podrá actuar.

15. FRAGMENTACIÓN DEL
ADN
El conjunto formado por la
metilasa y la endonucleasa es
lo que se denomina sistema de
modificación - restricción.
Aunque los enzimas varían en
algunos aspectos de sus
condiciones de actuación, se ha
observado que todos ellos
requieren Mg y actúan a un Ph
óptimo de entre 7.2 y 7.8.

16. FRAGMENTACIÓN DEL ADN

17. FRAGMENTACIÓN DEL ADN
Una vez que se ha fragmentado el ADN,
podemos separar el fragmento que nos
interesa mediante una electroforesis en gel
de agarosa. Sin embargo debido a la
digestión obtendremos numerosos
fragmentos de distintos tamaños, por ello es
mucho más práctico construir, antes de
clonar nuestro fragmento, una librería de
ADN

18. AMPLIFICACIÓN POR PCR
La reacción en cadena de la
polimerasa es una técnica que nos
permite obtener artificialmente y de
una forma más rápida, múltiples
copias de nuestro fragmento de
DNA.
A medida que se repiten los
ciclos los productos de DNA
unidos a los cebadores se
amplifican en proporciones
geométricas: 2,4, 8, 16…

19. UNIÓN DEL ADN CLONADO AL
VECTOR
Un vector es una molécula de DNA con
un origen de replicación autónomo y Se utilizan el
que posee zonas donde pueden vector(virus
introducirse fragmentos de ADN bacteriófagos)
exógeno. Así, el ADN exógeno se pET28
replica como parte del vector en la ósea virus de
célula receptora y hospedadora. bacteria. Como
todos los virus,
La infección viral permite que un fago se hace
cada célula hospedadora reproducir por
contenga muchas copias del la célula a la
gen exógeno y que éste se cual infecta
exprese abundantemente

20. TRANSFORMACIÓN DE LA CÉLULA
HOSPEDERA
Cuando el ADN exógeno ha sido
ligado en el vector, debe entonces
introducirse en la célula hospedadora.
Las más usada es E. coli.
Mediante este paso se puede formar
nuevas copias de ADN o permitir la
síntesis de las proteínas cuya
información contiene el ADN clonado.

21. EXTRACCIÓN DE LA PROTEÍNA
HEPES o ácido 4 (2-
hidroxietil), 1- piperazin-
ethano-sulfónico
En el presente trabajo, la E. coli fue cultivada en
Terrífic Broth y después congeladas en nitrógeno
líquido .
Posteriormente fueron descongeladas y
resuspendidas en tampón HEPES antes de la
extracción de las proteínas.
Las proteínas formadas por E. coli a partir
del ADN clonado en su genoma, se extraen
mediante lisis de su membrana celular y
centrifugación. Con el propósito de separar
las moléculas según su tamaño molecular.

22. PURIFICACION DE PROTEINAS
Las proteínas obtenidas mediante
centrifugación son captadas mediante
perlas de níquel Ni, y luego son eluidas
antes de pasar a la cromatografía de
exclusión molecular.

23. PROCEDIMIENTOS
1.Seleccionar al ADN
2. Fragmentación del ADN
3. Amplificación del ADN
con PCR.
4. Introducción del ADN en un
vector.
5. Infección de bacterias E.
coli con el vector.
6. Cultivo de E. Coli en Terrífic
Broth.
7. Extracción de las proteínas.

24. PROCEDIMIENTOS
8. Cromatografía de
exclusión.
9. Cristalización con método de
sitting-drop
10. Análisis cristalográfico.

25. CRISTALIZACION
 Es un proceso mediante el cual las
moléculas se van a ordenar y van a formar
los cristales.

26. GOTA COLGANTE

27. GOTA SENTADA

29. CRISTALIZACIÓN POR
DIFRACCIÓN DE RAYOS X

30. Instrumentos Reactivos
cristalización de difusión del vapor 5mM DE ADP
19ID LINEA SE LUZ DE LA 1:100 quimiotripsina (w/w)Y 0.5ul
ADVANCED PHOTON SOURCE solución de proteína también
(APS) EN NA LONG. DE ONDA DE contiene 15% de glicol
0.9792ANSTRON polietileno(PEG)400
COOT
REFMAX de acetato de amonio
PHENIX citrato de sodio 0.1 M, pH 5.6.
MOLPROBITY
ADVANCED PHOTON SOURCE cristal SeMet se cultivo 14.555
(APS) PEG4000,acetato de amonio0.2 M,
0.1M de citrato de sodio

32. ESTRUCTURA DEL DOMINIO
QUINASA DE LA GNE
 La estructura general
adopta una tipica
arquitectura bilobal.
 Tanto el lóbulo –N como
el lóbulo –C tienen la
doble α/β.
 Cada lóbulo consta de
una β-hoja central
flanqueada por alfa-
hélices en ambos lados
de la hoja.

33. ESTRUCTURA DEL DOMINIO
QUINASA DE LA GNE
El dominio quinasa GNE contiene un motivo
unido al zinc de tipo I que forma un tipo de
dedo de zinc HC3 con residuos H569 y
C579 y C581 y C586. El motivo de unión al
zinc es un rasgo característico de todos los
miembros de la familia ROK.
El dominio de la quinasa también contiene
un tipo de motivo DxGxT que se une al ATP
y está localizado en la hendidura entre los
dos lóbulos.

34.  El dominio quinasa de GNE es
responsable de la dimerización,
mientras que un segmento de los
residuos entre la epimerasa y
dominios quinasa, residuos 360-
382, es un sitio potencial para la
trimerización.
 Datos obtenidos por filtración en
gel muestran que el dominio
quinasa existe principalmente
como un dímero en la solución, con
pequeñas cantidades de
monómero y un oligómero de
orden superior. El peso molecular
aparente del oligómero se ajusta a
un hexámero del dominio quinasa,
aunque no se puede descartar la
posibilidad de un tetrámero.

35. DÍMERO DEL DOMINIO QUINASA DE LA
GNE
A: Representación
del dímero del
dominio quinasa de
la GNE
B: Vista ortogonal
de la superficie de
un monómero

36. ANÁLISIS OLIGOMÉRICO DEL DOMINIO
QUINASA DE LA GNE
A: Hexámero
cristalográfic
o obtenido
por rotación
de un trímero.

37. HEXÁMERO CRISTALOGRÁFICO
DE LA GNE
B: Vista desde abajo del
hexámero cristalográfico
tras un giro de 90 grados.

38.  La búsqueda de homología estructural
del dominio quinasa de la GNE con el
FatCat del servidor reveló los cuatro
primeros éxitos no redundantes como
los códigos PDB 2aa4, 1xc3, 1z05 y
1z6r.Todas estas estructuras
contienen el característico motivo
vinculado a zinc de la familia de los
ROK.

39.  A: Alineación estructural de la quinasa de
GNE (rojo, 3eo3) con la glucoquinasa de E.
coli + complejo de glucosa (gris, 1sz2).

40.  B: Alineación estructural del segmento vinculado
al azúcar en las dos proteínas (GNE y
glucoquinasa de E. coli). Se indican los residuos
clave (verde), los residuos unidos al zinc (azul) y
los residuos cuya mutación está implicada con el
HIBM (rojo).

41. Al comparar la GNE con la glucoquinasa
de E. coli (AP: 1sz2), la más cercana
estructura homóloga según la base de
datos PDB, se observa que los cinco
residuos implicados en la unión de
azúcar se conservan en GNE (N516,
D517, E566, H569, E588, numeración
de GNE). Dos residuos, H569 y E588,
están situados en el motivo
característico vinculado a zinc de la
familia ROK y H569 directamente
coordina el ion zinc.

42. ANALISIS ESTRUCTURAL DE MUTTACIONES PUNTIFORMES
ASOCIADASA HIBM EN EL DOMINIO QUINASA DE GNE

43. MUTACIONES PUNTIFORMES
TIPO I EN EL DOMINIO QUINASA
DE LA GNE
• Está formado por los residuos I557, G559, V572
y G576; los dos últimos se encuentran en la
interfase de dimerización del lóbulo -C y la
mutación de estos residuos pueden interferir
con la dimerización del dominio quinasa.
• La dimerización del dominio quinasa no afecta
la accesibilidad disolvente de G576, indicando
que G576 no está directamente implicada en la
dimerización.

44. MUTACIONES PUNTIFORMES
TIPO II EN EL DOMINIO QUINASA
DE LA GNE
 El segundo grupo de residuos
incluye los situados en las hélices
interfaciales entre el lóbulo -N y el
lóbulo-C, es decir, N519, A524,
F528, G708, y M712.
 Como éste es el sitio de unión al
ATP y los hidratos de carbono, la
mutación de estos residuos puede
cambiar el movimiento interlobular
durante la catálisis y por lo tanto
afectar a la actividad de la quinasa
de la proteína.

45. MUTACIONES PUNTIFORMES TIPO
III EN EL DOMINIO QUINASA DE LA
GNE
 El tercer grupo incluye al residuo P511, el
cual tiene la mayor accesibilidad relativa
como disolvente (> 40%) de los 23 sitios de
mutación y está situado en una región de
bucle de la estructura. La mutación de una
prolina a cualquier otro tipo de residuo, va a
cambiar la flexibilidad de la región de bucle
alrededor de este residuo y podría cambiar el
alosterismo de longitud completa de GNE en
el estado oligomérico de orden superior.

46. MUTACIONES PUNTIFORMES
TIPO IV EN EL DOMINIO
QUINASA DE LA GNE
 El cuarto grupo de residuos incluye todo el
resto de los sitios de mutación. Todos tienen
cadenas laterales hidrófobas y de baja
accesibilidad a solventes, y se encuentran
dentro de los elementos estructurales
secundarios. Las mutaciones de estos
residuos podrían interferir con las
interacciones hidrofóbicas de los elementos
de la estructura secundaria que estabilizan la
estructura de la proteína cuaternaria.

47. Son trastornos neuromusculares
caracterizados por debilidad muscular es
más común en la etapa del adulto
En lo cual se ve comprometiendo
los cuádriceps y los flexores
profundos de los dedos de la
mano.

48. INCLUSIÓN MIOPATÍA
HEREDITARIA DEL CUERPO
(HIBM)
Miopatías hereditarias comprenden tanto autonómica
recesiva y autonómica dominante de trastornos
musculares que tienen una expresión variable
( fenotipo ) en los pacientes individuales

49. CLASIFICACIO
N
Una forma autosómica dominante (IBM1), donde
los cuádriceps son uno de los primeros músculos que se
debiliten.
Una forma autosómica recesiva como Nonaka miopatía distal

50. MIOPATIA DISTAL TIPO
NONAKA
Genéticamente la miopatía distal de Nonaka se hereda
en forma autosómica recesiva y el defecto genético se
ha localizado en el cromosoma 9p1-q1(23
Se caracteriza por ser una Enfermedad de los músculos
distales porque afectan sobre todo a las extremidades.

51. COMO SE MANIFIESTA
La afectación se manifiestan presentando debilidad muscular en el
compartimento anterior de las piernas, y en los músculos extensores. Los
pacientes presentan pie caído con mucha dificultad de flexionar. también
puede originar deformaciones articulares. Posteriormente se ven afectados
los muslos y los miembros superiores.

52. ¿CUAL ES LA
CAUSA?
La miopatía de Nonaka está asociada a la alteración del gen GNE
(UDP-N-acetilglucosamina-2-epimera-sa/N-acetilmanosamina
quinasa) ) implicada en la ruta biosintética del ácido siálico .es decir
originando carencia de acido sialico

53. SIGNOS Y SINTOMAS
• Calambres
• Dificultad para caminar sobre los
talones
• Dificultad para correr
• Pérdida de equilibrio.
• Miotonia
• Fatiga

54. DIAGNOSTICO
El diagnóstico clínico de la HIBM se
confirma:
• Estudio electrofisiológico (EMG)
• Examen de sangre para la creatina
quinasa sérica (CK o CPK)
• Biopsia muscular
• Resonancia Magnética (RM) o
tomografía computarizada (TC)

55. CONCLUCIONES
El dominio Quinasa de la Proteína GNE es
la única proteína humana conocida que
forma parte del grupo de proteínas
bacterianas ROK
Al comparar la proteína GNE con otras
proteínas estudiadas como las proteínas ROK,
se revelo que hay sitios en común que son
básicamente los Sitios de Unión a Sustrato
ubicados en la Fisura Interlobular y también en
lo referido al Motivo unido al Zinc

56. CONCLUCIONES
Se han encontrado Mutaciones
Puntiformes asociadas con la Miopatía
Hereditaria con Cuerpos de Inclusión
(HIBM).
La estructura cristalina del dominio
Quinasa de la GNE es la base para
comprender las Mutaciones causantes de
enfermedades como la Miopatía de
Cuerpos de Inclusión (HIBM