Universidad de Carabobo - Facultad de Ciencias de la Salud sede Carabobo - Bioanálisis. Técnicas en Biología Molecular. Unidad 1: Extracción de ácidos nucleicos.

1. Universidad de Carabobo
Facultad de Ciencias de la Salud
Escuela de Bioanálisis
Asignatura Técnicas en Biología Molecular
FACULTAD DE CIENCIAS
DE LA SALUD
ESCUELA DE
BIOANÁLISIS

2. • Ácidos Nucleicos
• Extracción de DNA: Lisis
celular, desproteinización,
precipitación
• Extracción de RNA:
Homogenización, eliminación
de contaminantes, recuperación
• Cuantificación de Ácidos
Nucleicos
MSc. Diana Graterol
Principios Básicos de la
extracción de RNA y DNA

3. Ácidos Nucleicos
DNA
GRUPOS FOSFATOS
PENTOSA
BASES NITROGENADAS
RNA
3

4. Ubicación de los Ácidos Nucleicos
Eucariotas: núcleo celular
Procariotas: citoplasma
Superenrrollado y asociado a proteínas
llamadas Histonas
4

5. Esqueletos covalentes: hidrofílicos
➢ Pentosa: enlace hidrógeno con el agua.
➢ Grupo Fosfato: carga negativa a pH 7.
Grupos laterales: hidrofóbicos
➢ Bases Nitrogenadas: insolubles en agua a pH
neutro. A pH ácido o alcalino adquieren carga y
aumenta solubilidad en agua.
Propiedades de los Ácidos Nucleicos
5

6. La extracción de
RNA o de DNA
consiste en la
purificación de
ácido ribonucleico
(RNA) o ácido
desoxirribonucleico
(DNA) presente en
las células u
organismos vivos o
muertos
Extracción de RNA y DNA
UTILIZACIÓN:
➢ Ciencia forense. Comparar
sospechosos con muestras de sangre,
cabello, saliva o semen debitadas.
➢ Identificación de restos humanos por comparación con
muestras de familiares.
➢ Estudiar la compatibilidad en donaciones de órganos.
➢ Pruebas de filiación.
➢ Construcción de genotecas.
➢ Molde en las reacciones de amplificación.
➢ Secuenciación.
6

7. DIVERSAS
FUENTES
TEJIDOS
SANGRE
CELULAS Y
CULTIVOS
Puede obtenerse de cualquier microorganismo, tejido, planta o
animal, en cualquier estadio de su desarrollo
Obtención de la Muestra
7

8. Extracción de DNA
La extracción de
DNA combina
procesos químicos,
físicos y mecánicos
e incluye
básicamente tres
pasos:
Lisis Celular
Desproteinización
Precipitación del DNA
Existen diferentes metodologías, que varían en sus componentes y
principios, pero que nos llevan al mismo objetivo, la obtención de
un DNA purificado y de calidad y listo para ser sometido a estudio
8

9. • Troceado o triturado
de la muestra original
en una solución
amortiguadora de pH
Fragmentación
mecánica
• Homogeneización
con tampones de
lisis: SDS, Tween-
20, Tritón X-100,
EDTA
Disgregación
Química
• Enzimas
específicas:
Colagenasa,
Proteinasa K
Tripsina
Digestión
Enzimática
Para iniciar la extracción del DNA la muestra debe estar en solución
homogénea, es decir células individuales
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1.- LISIS CELULAR

10. 1.- LISIS CELULAR
10
➢ Solubiliza lípidos de membrana,
rompe las interacciones hidrofóbicas.
➢ Lisa el núcleo ➔ Libera AN.
➢ Inhibe la actividad de nucleasas.
Ca+2 Ca+2
➢ Agente quelante.
➢ Impide ser cofactor de las
nucleasas.
➢Proteger el DNA.
➢Imposibilita la disponibilidad de los
iones Ca+2.
➢ Enzima proteolítica (Proteasa).
➢ Degrada las fracciones proteicas.
➢ Escisión de enlaces peptídicos.
EDTA
Proteinasa K
Detergentes (SDS)

11. 1.- LISIS CELULAR
Choque Osmótico:
Consiste en la exposición de las células a un medio extremadamente
hipotónico, lo que ocasiona la ruptura de la membrana plasmática y la
pérdida del contenido celular
Técnica de Miller y Dykes (1988): Se basa en la aplicación de soluciones lisantes que
permiten la ruptura celular, es utilizada comúnmente para extraer DNA de leucocitos a
partir de sangre.
Tampón de
Lisis
Células
sanguíneas
Núcleos
DNA dentro del
núcleo asociado a
Histonas
DNA libre del
núcleo y de las
Histonas
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12. Consiste en separar de la mezcla el DNA de las proteínas presentes en el medio
➢ Técnica Orgánica (Solventes).
➢ DNA de buena calidad y
cantidad.
➢ Proteínas son extraídas en la
fase orgánica (Fenol) después de
digestión con Proteinasa K.
➢ Cloroformo permite que todo el
fenol pueda ser lavado.
Desventajas:
➢ Reactivos altamente tóxicos.
➢ Perdidas significativas de DNA
Fenol /
Cloroformo /
Alcohol
Isoamílico
➢ Técnica de tipo Inorgánica.
➢ Utiliza reactivos bajos en
toxicidad.
➢ Permite visualizar la malla
de DNA.
Desventajas:
➢ Requiere una mayor cantidad
de muestra.
Salting Out
➢ Técnica Inorgánica.
➢ Previene la degradación
del DNA por quelación de
los iones metálicos durante
la ebullición al 5%.
➢ Los reactivos no son
tóxicos y no se pierde
DNA.
Desventajas:
➢ DNA aislado es de
cadena sencilla, utilizado en
PCR pero no en RFLP
Chelex
2.- DESPROTEINIZACIÓN
12

13. 2.- DESPROTEINIZACIÓN
Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamílico:
DNA
➢ Permite desproteinización.
➢ Elimina proteínas, lípidos y
polisacáridos.
➢ No degrada DNA por ser
básico.
Fenol
➢ Desnaturaliza proteínas.
➢ Suprime solubilidad de las
proteínas.
➢ Elimina impurezas (Fenol y
Alcohol Isoamílico).
➢ Facilita separación de las
fases.
Cloroformo
➢ Apolar.
➢ Remueve lípidos y
proteínas.
➢ Separación nítida de las
fases.
➢ Previene la formación de
espuma.
Alcohol
Isoamílico
➢ Solución neutra o alcalina de Fenol/Cloroformo/Alcohol
Isoamílico (25:24:1).
➢ Solución es insoluble en agua, formación de dos fases.
➢ Cuando la mezcla se agita vigorosamente las proteínas son
desnaturalizadas y precipitadas a la interfase, mientras que el DNA
se encuentra en la fase líquida superior.
13

14. Recuperación del DNA disuelto en el medio que se logra con la
adición de alcoholes (Isopropanol o Etanol) en presencia de iones
monovalentes
Isopropanol
Las sales compiten
con el agua por las
cargas negativas
del DNA haciéndolo
insoluble en el
medio acuoso
AN son menos solubles en alcohol que agua. La adición de sal
disminuye solubilidad al competir por los dipolos del agua
3.- PRECIPITACIÓN DEL DNA
14

15. Extracción con Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamílico
LISIS CELULAR DESPROTEINIZACIÓN
PRECIPITACIÓN
Tampón de lisis:
Proteinasa K,
SDS, EDTA
Protocolos de Extracción DNA
15

16. Protocolos de Extracción DNA
Extracción por el Método Salting Out
LISIS CELULAR
TAMPÓN DE LISIS II
INCUBACION CON SDS,
Proteinasa K, TE 20:5
ACETATO DE AMONIO
ISOPROPANOL 99%
PRECIPITACIÓN 16

17. Protocolos de Extracción DNA
Extracción con Resina Chelex-100
Resina quelante con alta afinidad por iones metálicos
DNA 17

18. Protocolos de Extracción DNA
Extracción con Esferas Magnéticas (GeneMAG-DNA/RNA)
Nueva herramienta, sencilla y muy eficiente para el aislamiento de
RNA / DNA con esferas magnéticas de sílice
MUESTRA + SOL.
LISIS
SE AGREGAN LAS
PARTÍCULAS
MAGNÉTICAS
SE APLICA UN IMÁN QUE
ATRAE LAS
PARTÍCULAS+DNA
PARTÍCULAS MAGNÉTICAS SE
ADHIEREN AL DNA
TAMPÓN DE ELUCIÓN
DE DNA
SE EXTRAE EL
SOBRENADANTE (DNA)
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19. Extracción de RNA
La extracción de
RNA combina
procesos químicos,
físicos y
mecánicos e
incluye
básicamente tres
pasos:
Homogenización de la muestra
Eliminación de Contaminantes
Recuperación de AN
Obtención de un RNA purificado y de calidad y listo para ser
sometido a estudio
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20. Ultrasonicación
Compresión-
descompresión
Blender
(Licuadora)
Homogenizador de
esferas de vidrio
Métodos Físicos:
Homogenizador de
émbolo y tubo
Mortero
Congelación-
descongelación
1.- HOMOGENIZACIÓN
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21. 1.- HOMOGENIZACIÓN
Métodos Químicos:
Detergentes (SDS, Tritón X-100)
Enzimas
Agente reductor (2-βmercaptoetanol)
Aislamiento de RNA:
DEPC: inactiva RNasa
Tiocianato de Guanidina: inhibidor de RNasas
DNasas
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22. 1.- HOMOGENIZACIÓN
22
➢ Detergente.
➢ Lisa las membranas celulares.
➢ Captura lípidos y proteínas de
membrana.
➢ Agente quelante.
➢ Cataliza la hidrólisis de las bases
nitrogenadas.
➢ Evita contaminación con
polisacáridos.
➢ Rompe estructura tridimensional de
macromoléculas.
➢ Inhibe enzimas.
Citrato de Sodio
Acetato de Sodio
N-Lauril Sarcosina
Detergentes

23. 1.- HOMOGENIZACIÓN
➢ Agente caotrópico.
➢ Desnaturaliza proteínas.
➢ Inactiva Ribonucleasas.
➢ Antioxidante.
➢ Rompe enlaces disulfuros.
➢ Inactiva proteínas.
Tiocianato de
Guanidina
β-Mercaptoetanol
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24. 1.- HOMOGENIZACIÓN
H2O libre de Nucleasas:
Dietil pirocarbonato ➔ C6H10O5
Efecto inhibidor de Nucleasas
➢ Reacciona con múltiples enzimas que contienen en sus grupos activos -NH,
-SH, -OH, entre ellas las RNasas, inactivándolas.
➢ Utiliza al 1% en agua bidestilada, suficiente para inactivar RNasas.
➢ DEPC irrita ojos, piel y membranas mucosas.
➢ Potencial cancerígeno.
Nucleasas: Rompe enlaces fosfodiéster de las
cadenas polinucleotídicas
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25. Precipitación Salina Diferencial
Extracción con Solventes Orgánicos
Centrifugación
Cromatografía
Microesferas Magnéticas
2.- ELIMINACIÓN DE CONTAMINANTES
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26. El método espectrofotométrico está basado en la medida directa de la absorción de la radiación
electromagnética por parte de la muestra, siendo esta cuantificable mediante la correlación de la
Absorbancia (OD) con la concentración del ácido nucleico a determinar.
Método Cuantitativo:
La Pureza se estima utilizando la relación A260/A280, y debe ser aproximadamente 1,8
para DNA y 2 para RNA.
La razón A260/A280 puede utilizarse para observar, la contaminación con carbohidratos,
EDTA, buffer, péptidos o fenol (>2).
➢ Ácidos Nucleicos 260 nm.
➢ Proteínas 280 nm.
DO a 260 nm = 50 μg/mL DNA o 40 μg/mL RNA
Cuantificación de Ácidos Nucleicos
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27. Cuantificación de Ácidos Nucleicos
Permite calcular la cantidad de ácidos nucleicos a partir de la intensidad de la
fluorescencia emitida por el bromuro de etidio irradiado con luz UV
Método Semicuantitativo:
Bromuro de Etidio:
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28. Ambiente adecuado, limpio y aislado Serie de reactivos listos y material estéril
Consideraciones
28

29. ➢ Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noorda J. (1990). Rapid and simple method for
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Reverte.
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Bibliografía
29