PCR

1. REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
Microbiología de los Alimentos
Ingeniería en alimentos
2015

2. • Desarrollada por Kary Mullis en 1986
• Técnica in vitro que permite amplificar enzimáticamente una
región determinada de ADN, la cual se encuentra flanqueada
por 2 secuencias de ADN conocidas
• Se basa en el mecanismo de replicación in vivo de ADN: El
ADN bicatenario se desenrolla pasando a monocatenario,
duplicándose y volviéndose a enrollar.

3. Pasos para realizar una PCR
1) Extracción del ADN deseado
2) Preparación de la mezcla de reacción (Master mix)
3) Separación de master mix en alícuotas y agregado del
ADN de interés
4) Amplificación en Termociclador
5) Electroforesis en gel de agarosa
6) Observación en transiluminador UV

4. 1- Extracción de ADN
Existen distintos métodos para extracción de ADN.
Técnica A:
Enriquecimiento de
bacteria en medio
de cultivo Ansada
Resuspender en 150µl
de Triton X-100 en
buffer TE
Hervir a baño de agua a
100°C 15 minutos
Centrifugar a
12000 rpm 5
minutos
Tomar 50 µl del
sobrenadante y
colocar en tubo
nuevo
ADN listo para PCR

5. Técnica B: Kit comercial de extracción QIAamp

6. Componentes de la Master Mix
H2O ultrapura
Buffer
Mg+2
dNTPs
Primer forward
Primer reverse
ADN polimerasa
+ ADN de interés
Termociclador

7. Preparación de Master mix
Reactivos Solución stock Solución de
trabajo
Volumen en la
mezcla (µl)
Buffer 10 x 1x
dNTPs 2,5 mM 0,1 mM
MgCl2 25 mM 1,5 mM
Iniciador a 100 pmol/µl 2 pmol/µl
Iniciador b 100 pmol/µl 2 pmol/µl
Taq pol 5 U/µl 0,02 U/µl
ADN templado 2
H2O ultrapura
Volumen final 50

8. Pasos durante la amplificación
1) Desnaturalización inicial
2) Ciclos: - Desnaturalización
- Unión o annealing
- Extensión
3) Extensión final
Importancia de los controles:
Control Positivo: ADN diana que se sabe amplifica el gen buscado. Permite verificar que
este correcto el procedimiento.
Control Negativo: Componentes de Master mix sin ADN. Permite ver que no haya
contaminación.
92 - 94°C
92 – 94°C
55 – 61°C
72 – 74°C
72 – 74°C

10. Cuidados a tener en cuenta
Trazas de ADN contaminante podrían servir como ADN molde, llevando a la amplificación de un fragmento
incorrecto (FALSOS POSITIVOS). Para evitarlo es fundamental:
• Trabajar en condiciones de asepsia
• Lugar de trabajo bien limpio, trabajar con guardapolvo, guantes
• Material que se utiliza debe estar esterilizado
• Preferible si es material nuevo
• Evitar corrientes de aire
Zonas de trabajo
Recomendable: zonas de trabajo físicamente separadas y dotadas de material adecuado.
• Zona de preparación de la muestra: Extracción y purificación del material genético.
• Zona de PCR: preparación de master mix y muestras.
• Zona post-PCR: donde se realiza la amplificación de ADN.

11. Revelado
Los fragmentos de PCR se revelan mediante
electroforesis en gel de agarosa.
Gel de agarosa y buffer
de corrida TAE o TBE
Siembra 5 µl de muestra
+ 2 µl de azul de
bromotimol
Visualización

12. Conceptos básicos
• Especificidad: Generación de un único producto de amplificación.
• Eficiencia: Máxima producción de amplificación en función del número de ciclos.
• Fidelidad: Número de errores que comete la DNA polimerasa durante la copia (menor número de
errores, mayor fidelidad).
• Sensibilidad: Mínima cantidad de ADN que se necesita para obtener una gran cantidad de copias
Aplicaciones
En Microbiología:
• Identificación de microorganismos por presencia de una secuencia especifica del gen 16S ARNr u otros genes
específicos de especie
• Selección de clones que posean genes asociados a virulencia, resistencia a antibióticos, etc.
• Establecer relación entre cepas durante brotes o estudio epidemiológicos
En otras áreas:
• Identificación de genes para diagnostico y medicina legal
• Investigación de modelos de expresión

13. Ventajas
• A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable
• Rapidez en el diagnostico
• Mayor sensibilidad que los cultivos
• Se puede amplificar ADN de cualquier organismo, vivo o muerto
• El fragmento obtenido se puede clonar, secuenciar y analizar
Desventajas
• Se pueden reproducir partes del genoma cuya secuencia se conoce y consta de 20 a 40 pb de longitud
• Se necesitan “PRIMERS” específicos
• La enzima ADN polimerasa puede tener errores al sintetizar
• Puede contaminarse con otro ADN
• Reactivos costosos

14. Tipos de PCR
Nested PCR
Técnica muy sensible de PCR en la
que el producto de amplificación
es utilizado como molde para
realizar una segunda amplificación
con cebadores que se ubican
dentro de la primera secuencia
amplificada.
Ventajas: brinda alta sensibilidad y
especificidad
Desventajas: no permite
cuantificar la muestra

15. PCR multiplex
PCR en la cual se amplifica
simultáneamente dos o más
secuencias. Para lo cual se
combinan dos o más pares
de cebadores en el tubo de
la mezcla junto con los
demás reactivos.

16. RT- PCR
Variante de PCR en
donde una hebra de ARN
mensajero es transcripta
a ADN complementario
(ADNc) usando la enzima
retrotranscriptasa, y el
resultado se amplifica
como una PCR
tradicional.

17. Aplicaciones en el
laboratorio de
Microbiología

18. Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio de los productos de
amplificación obtenidos por nested-PCR cuando distintas concentraciones de Y. enterocolitica
W1024 fueron inoculadas en chorizo de puro cerdo. (a) ADN extraido mediante el protocolo
desarrollado por Kapperud y modificado en el presente trabajo, (b) ADN extraído mediante el
reactivo PrepMan Ultra. Línea M: marcador de peso molecular de 100pb; C (-): control
negativo.
Sensibilida
d de la
técnica
nested-
PCR para
el gen
yadA

19. PCR
múltiplex
para la
determinaci
ón de la
presencia de
genes de
virulencia
Electroforesis en gel de agarosa
para ver los fragmentos de PCR
multiplex de Yersinia
enterocolitica para los genes Inv y
yst.
1: Cepa 51, B2/O:9: Inv: 558pb ;
yst: 192pb
2: Cepa 52, B2/O:9: Inv: 558pb ;
yst: 192pb
3: Cepa 53, B2/O:9: Inv: 558pb ;
yst: 192pb
4: Cepa 64, B4/O:3: Inv: 558pb
5: Marcador de peso molecular
6: Cepa 68, B4/O:3: Inv: 558pb ;
yst: 192pb
7: Cepa de referencia, W1024,
B2/O:9: Inv: 558pb ; yst: 192pb
8: Cepa de referencia, MCH700,
B4/O:3: Inv: 558pb ; yst: 192pb
9: Control negativo
10: Marcador de peso molecular
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10

20. Resistencia a ATM de Helicobacter pylori
El mecanismo de resistencia a Cla esta asociado a mutaciones
puntuales en la región peptidiltransferasa del gen 23s RNAr
principalmente en las posiciones 2142 y 2143 en las cuales una
guanina o citocina reemplazan una adenina.
ACGGAAAGACC WT S CLA
ACGGGAAGACC A2142G R
CLA
ACGGAGAGACC A2143G R
CLA
Corte con enzima
BsaI
Corte con
enzima MboII
Amplificación fragmento
450 pb

21. Bibliografía
• Somma M, Querci M. Análisis de la presencia de
los organismos genéticamente modificados en
muestras de alimentos. Sesión N°6
• Torres Tejeda AG, Baca BE. Reacción en cadena de
la polimerasa. Centro de investigación
microbiológica. Instituto de ciencia. Universidad
de puebla.