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Reacción en cadena de la polimerasa

Reacción en cadena de la polimerasa Introduccion Concepto fundamentos Aplicaciones Materiales Etapas Ventaja/Desventada

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Universidad Autónoma deYucatán
Facultad de Odontología

Reacción en cadena de la
polimerasa

Equipo 2

Carlos Cetina
Bibiana Dzib
Mariceli López

Conocida como PCR por, es una técnica de biología molecular
desarrollada en 1987 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un
gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo
de un mínimo.
En teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.

Maria Jose Nuñez
Jordan Rodríguez
Aleika Romero
Miguel Villaseñor
Concepto
Fundamentos de la técnica

Reacción en
cadena de la
polimerasa (PCR)

Miguel Villaseñor

Utilidad

Índice

Maria Jose Nuñez

Aleika Romero

Elementos que se requieren
para realizar la prueba

Carlos Cetina

Material y Equipo

Jordan Rodríguez

Etapas de la Técnica

Mariceli López

Ventajas y Desventajas

Bibiana Dzib

Conclusión
Concepto
¿Qué es PCR?

 La reacción en cadena de la
polimerasa es considerada
una técnica biotecnológica
cuya finalidad es la
amplificación o
reproducción in vitro de un
número de copias
La reacción en cadena de la
polimerasa fue desarrollada
en 1983 por el Doctor
Kary Mullis
Premio Nobel Química (1993)

 de una región específica de
ADNAl simular la forma en
como se replica al ADN de
forma natural
Sensibilidad

Eficiencia:
• se refiere a la
amplificación máxima
que se puede obtener en
un número determinado
de ciclos.

• la capacidad del test
para detectar la
enfermedad.

conceptos
Fidelidad
Especifidad
•
se puede definir la
especificidad como la
capacidad para
detectar a los sanos.

Conceptos

• se refiere a los errores que
comete la ADN polimerasa
durante la amplificación.
• Este concepto es de especial
importancia en la
secuenciación, pero en otros
casos no es tan importante. Una
buena fidelidad permite evitar
falsos positivos y/o negativos.
PROCESO
PCR
Partiendo de un DNA
molde, una enzima
polimerasa incorpora
nucleótidos
complementarios a
partir de la zona de
doble cadena originada
por la unión de los
cebadores al molde

En primer lugar es necesario que el DNA se
desnaturalice, O sea que las dos cadenas de
DNA se separen y para que esto pase se eleva
la temperatura aproximadamente a 90°C

•

El siguiente paso consiste en un
descenso de la temperatura para
permitir que los cebadores se unan
por complementariedad al DNA
molde

•

Temperaturas habituales en esta
fase oscilan entre 35 y 60ºC

la enzima polimerasa incorpora
nucleótidos complementarios

¿Qué se ha
obtenido tras un
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PCR?
Únicamente
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Reacción en cadena de la polimerasa

  • 1. Universidad Autónoma deYucatán Facultad de Odontología Reacción en cadena de la polimerasa Equipo 2 Carlos Cetina Bibiana Dzib Mariceli López Conocida como PCR por, es una técnica de biología molecular desarrollada en 1987 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo. En teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Maria Jose Nuñez Jordan Rodríguez Aleika Romero Miguel Villaseñor
  • 2. Concepto Fundamentos de la técnica Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Miguel Villaseñor Utilidad Índice Maria Jose Nuñez Aleika Romero Elementos que se requieren para realizar la prueba Carlos Cetina Material y Equipo Jordan Rodríguez Etapas de la Técnica Mariceli López Ventajas y Desventajas Bibiana Dzib Conclusión
  • 4. ¿Qué es PCR?  La reacción en cadena de la polimerasa es considerada una técnica biotecnológica cuya finalidad es la amplificación o reproducción in vitro de un número de copias La reacción en cadena de la polimerasa fue desarrollada en 1983 por el Doctor Kary Mullis Premio Nobel Química (1993)  de una región específica de ADNAl simular la forma en como se replica al ADN de forma natural
  • 5. Sensibilidad Eficiencia: • se refiere a la amplificación máxima que se puede obtener en un número determinado de ciclos. • la capacidad del test para detectar la enfermedad. conceptos Fidelidad Especifidad • se puede definir la especificidad como la capacidad para detectar a los sanos. Conceptos • se refiere a los errores que comete la ADN polimerasa durante la amplificación. • Este concepto es de especial importancia en la secuenciación, pero en otros casos no es tan importante. Una buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.
  • 6. PROCESO PCR Partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión de los cebadores al molde En primer lugar es necesario que el DNA se desnaturalice, O sea que las dos cadenas de DNA se separen y para que esto pase se eleva la temperatura aproximadamente a 90°C • El siguiente paso consiste en un descenso de la temperatura para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al DNA molde • Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60ºC la enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios ¿Qué se ha obtenido tras un ciclo de PCR? Únicamente una copia de un pequeño fragmento del DNA molde La temperatura depende de los cebadores
  • 7. ADN PROCESO PCR •Este DNA se conoce como DNA molde.  Componentes de la PCR Estos cuatro componentes son los elementos básicos que es necesario incorporar a la reacción para que se complete una PCR. • El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento, es decir, el DNA que queremos amplificar. DNA polimerasa (sintético) •Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde: una •La reacción se lleva a cabo en un tampón apropiado para el funcionamiento de la enzima polimerasa. Además, como cofactores de la polimerasa se añaden cationes divalentes, generalmente en forma de cloruro de magnesio cebadores o primers (sintéticos) • Iniciadores de la reacción • Son necesarios por tanto moléculas cortas de DNA de cadena sencilla. Nucleótidos Libres Partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión de los cebadores al molde • las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos libre
  • 8. PCR La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica fundamental para la mayor parte de las aplicaciones de la biología molecular. Conclusión ADN Molde  Es una técnica de biología molecular desarrollada en 1987 por Dr.Mullis que Permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA DNA polimerasa Desnaturalizar el ADN, eleva la temperatura aprox a 90°C • Descenso de la entre 35 y 60ºC la enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios cebadores o primers Nucleótids Libres
  • 10. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980.
  • 11. Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen La clonación de ADN para la secuenciación, La detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas La filogenia basada en ADN El análisis funcional de genes La identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) El diagnóstico de trastornos hereditarios
  • 13. Forma de clonación “in vitro”  Sistema de amplificación que nos permite la obtención de un millón de copias del DNA original en pocas horas
  • 14. ¿Cuáles son los fundamentos? EXTENSIÓN DEL CEBADOR La DNA polimerasa realiza la extensión del primer utilizando la cadena complementaria como molde
  • 15. Eventos de la replicación del DNA Apertura de las cadenas (origen de replicación) Colocacion de los iniciadores (primers de RNA) Sintesis de la cadena de DNA (partiendo de los iniciadores) Eliminación de los iniciadores Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA ligasa)
  • 16. Hebra templado Elementos que se requieren en la sintesis de DNA por PCR Iniciador (cebador, primer) secuencia corta de nucleótidos complementaria de la hebra templado. dNTPs: desoxirribonucleótidos tri-fosfato DNA polimerasa
  • 17. Ventajas de PCR sobre otras técnicas Alta sensibilidad Alta especifidad Rapidez Desvantajas: PROBLEMAS DE CONTAMINACIÓN
  • 19. Objetivo: Obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
  • 20. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil:  . identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado
  • 21. Conocimiento de la estructura y función de los genes. Aplicaciones en la investigación básica El análisis de los niveles de los distintos ARN mensajeros (ARNm) presentes en una célula. La técnica PCR puede ser utilizada, en algunos casos, para clonar genes cuya secuencia de bases es desconocida. Puede ser utilizada para cambiar la información contenida en un segmento de ADN.
  • 22. Aplicaciones en el diagnóstico médico Existen métodos de detección por PCR de agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C, del papiloma humano, de Epstein Barr y citomegálico. Es posible detectar regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) a partir de sangre extraída de pacientes seropositivos. La técnica PCR ha facilitado enormemente el diagnóstico de enfermedades hereditarias como hemoglobinopatías (talasemias y anemia falciforme), la fenilcetonuria, las hemofilias A y B, la deficiencia de alfa 1 antitripsina, la distrofia muscular y la fibrosis quística. En enfermedades oncológicas pueden detectarse mutaciones de oncogenes. Se han implementado métodos que utilizan la PCR destinados a la evaluación del riesgo de padecer trastornos autoinmunes, tales como diabetes de tipo I, enfermedad celíaca, pénfigo vulgaris, miastenia gravis y esclerosis múltiple.
  • 23. Elementos que se requieren para realizar la prueba
  • 24. Elementos que se requieren para realizar la prueba Son 4 elementos básicos
  • 25. El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento. 1) DNA molde La concentración de la DNA molde en la reacción depende de la fuente utilizada. Se requieren aproximadamente de 300 nanogramos a 1 microgramo de DNA genómico.
  • 26. Es una enzima capaz de copiar una secuencia de nucleótidos. 2) DNA polimerasa Inicialmente se utilizaba la DNA polimerasa de Escherichia coli. → inestabilidad térmica Existe una gran variedad de polimerasas con diferentes capacidades a la hora de trabajar con diferentes temperaturas.
  • 27. La más habitual es la Taq DNA polimerasa, de la bacteria Thermus aquaticus, → capaz de funcionar a altas temperaturas Para conseguir una alta fidelidad es común usar la polimerasa Phusion, mucho más cara, pero es más rápida y con menor frecuencia de error.
  • 28. También son conocidos como oligonucleótidos sintéticos iniciadores. 3) Cebadores o primers Iniciadores de la reacción La longitud de los oligonucleótidos es de 15 a 30 nucleótidos.
  • 29. Su secuencia debe presentar la mayor similitud posible con la secuencia del DNA blanco, ya que de ello depende el éxito y la especificidad de la amplificación. La complementariedad debe de ser cerca de un 100% en las ultimas 5 a 6 bases del extremo 3’ del oligonucleótido → para asegurar la amplificación.
  • 30. Desoxirribonucleótidos de trifosfato (dNTPs) 4) Nucleótidos libres Las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de estos.
  • 31. Las concentraciones mínimas disminuyen el índice de incorporación errónea de los nucleótidos Concentraciones muy altas disminuyen la especificidad de la reacción. Concentraciones entre 20 y 200 μM proporcionan resultados óptimos.
  • 32. Buffer: Es una solución específica que magnifica la actividad de la polimerasa y mantiene el pH adecuado para su funcionamiento, normalmente contiene cloruro de magnesio Otros elementos . Iones divalentes: Actuan como cofactores de la polimerasa, generalmente en forma de cloruro de magnesio (MgCl2).
  • 34. Termociclador Materiales necesitamos a nivel práctico Microtubos. Micropipetas Puntas para las micropipetas Hielo
  • 35. Material: Los 4 desoxirribonucleótidostrifosfato (dNTP). Dos cebadores o iniciadores. Iones divalentes. (Mg2+) y (MgCl2). Iones monovalentes. Una solución tampón o buffer. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas. ADN molde.
  • 36. Tipos de PCR PCR anidada. PCR de extención solapada. PCR in situ. PCR multiple. PCR con transcriptasa inversa.
  • 37. Etapas de y Equipo Utilidad Material la Técnica
  • 38. El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente forma: partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión de los cebadores al molde. ETAPAS DE LA TÉCNICA ¿Cómo tiene lugar esta reacción? Como veremos a continuación los cambios de temperatura constituyen la base para que se completen los pasos necesarios. El proceso se lleva a cabo en tres fases Desnaturalización Hibridación Elongación
  • 39. Desnaturalización  En primer lugar es necesario que el DNA se desnaturalice, es decir, que las dos cadenas de DNA se separen. Esta primera fase se conoce como desnaturalización y se lleva a cabo elevando la temperatura a alrededor de 94ºC.
  • 40. HIBRIDACIÓN  Consiste en un descenso de la temperatura para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al DNA molde. Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60ºC  Especificidad de la reacción.
  • 41. Elongación o extensión  Por último, en la fase de elongación o extensión, la enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del extremo 3’ libre de la región en que han hibridado los cebadores. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa la temperatura de elongación suele ser de 72ºC.
  • 42. . ¿QUÉ SE HA OBTENIDO TRAS UN CICLO DE PCR?  Únicamente una copia de un pequeño fragmento del DNA molde. En este primer ciclo, los fragmentos generados no tienen el mismo tamaño: la copia de cada una de las cadenas se inicia, a partir del extremo 3’, en el punto en el que el cebador hibrida con el DNA molde y termina en el momento en el que la enzima polimerasa no es capaz de añadir más nucleótidos (es decir, que la nueva cadena formada no tiene un tamaño definido).
  • 46. Rapidez y sencillez de uso  La PCR permite clonar ADN en pocas horas, utilizando equipos relativamente poco sofisticados. VENTAJAS DEL “PCR”  Una reacción de PCR típica consiste en 30 ciclos de desnaturalización, síntesis y reasociación.  Por supuesto, el diseño y de los  Cada ciclo dura típicamente de 3 síntesis cebadores a 5 minutos y se utiliza un oligonucleótidos termociclador que lleva un también lleva tiempo, pero proceso ha sido microprocesador para programar este los cambios de temperaturas y el simplificado gracias a la aparición de programas número de ciclos deseado. informáticos para el diseño de los cebadores.  Una vez que se pone a punto, la reacción puede ser repetida de forma sencilla.
  • 47. Sensibilidad VENTAJAS  La PCR puede amplificar secuencias a partir de cantidades ínfimas de ADN diana, incluso a partir de ADN contenido en una sola célula.  La elevada sensibilidad ha permitido: Desarrollo de nuevos métodos para el estudio de la patogénesis molecular La aparición de numerosas aplicaciones (ciencia forense, diagnóstico, estudios de paleontología molecular, etc) donde las muestras pueden contener muy pocas células.  Sin embargo, el hecho de que el método tenga una sensibilidad tan elevada significa también que se deben extremar las precauciones para evitar la contaminación de la muestra con ADN extraño.
  • 48.  Esto hace que el método resulte muy adecuado para estudios de antropología y paleontología molecular,  El método se ha empleado con éxito también para la amplificación de ADN de muestras  La PCR permite la de tejidos fijadas con formol, lo amplificación de secuencias cual ha tenido importantes específicas de material que aplicaciones en patología contiene ADN muy molecular. degradado, o incluido en un medio que hace problemática su purificación convencional. Robustez VENTAJAS
  • 49. Necesidad de disponer de información DESVENTAJAS sobre la secuencia del DE “PCR” ADN diana  Para poder construir oligonucleótidos específicos que actúen como cebadores para la amplificación selectiva de una secuencia particular de ADN se necesita:  Disponer de alguna información previa sobre la propia secuencia a amplificar.  La región de interés ya debió haber sido parcialmente caracterizada, a menudo mediante la aplicación de métodos de clonación basados en sistemas celulares.
  • 50. DESVENTAJAS Tamaño corto de los productos de la PCR  Una desventaja clara de la PCR como método de clonación de ADN ha sido el tamaño de las secuencias de ADN que permite clonar.  La información de que se dispone sobre la mayor parte de secuencias clonadas por PCR sitúa el tamaño de los fragmentos clonados entre 0 y 5 Kb, tendiendo hacia el extremo inferior.  Los fragmentos pequeños se amplifican muy fácilmente, pero conforme aumenta su tamaño -> difícil obtener una amplificación eficiente.
  • 51. DESVENTAJAS Infidelidad en la replicación del ADN  La clonación del ADN en células pasa por la replicación del ADN in vivo, proceso asociado a una gran fidelidad de copiado debido a la existencia, en la célula, de mecanismos de lectura y corrección de errores.  Sin embargo, cuando el ADN se replica in vitro la tasa de errores cometidos durante el copiado se dispara.
  • 52. DESVENTAJAS Peligro de contaminació n  La facilidad con que se amplifica el ADN exige evitar el peligro de contaminación inherente al poder multiplicador de la reacción.  En un tubo en el que se ha realizado una reacción de PCR hay tal cantidad de ADN, que al salir caliente del termociclador y abrir este, el vapor alcanza el ambiente del laboratorio.  Hay peligro de contaminarse con otro ADN incluso puede ser del mismo investigador u otro.
  • 53. DESVENTAJAS  Necesidad de primers específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar  La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN
  • 55. Conclusión Final  La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica fundamental para la mayor parte de las aplicaciones de la biología molecular. Se ha presentado la base teórica y práctica de la PCR. Existen muchas variantes de la PCR convencional, como son la PCR en tiempo real o PCR cuantitativa [6] (que permite cuantificar la cantidad de producto amplificado) o la PCR por transcripción inversa (mediante la cual se obtiene una copia de DNA complementario, DNAc, utilizando como molde ácido ribonucleico, RNA). Existe gran cantidad de información referida tanto a la PCR convencional como a sus variantes .
  • 56.  http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Re acci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%20poli merasa.pdf  http://www.cobachelr.com/academias/quimicas/biologia/biologia/curtis/h isto/05bio/26.htm Bibliografías  http://www.chlaep.org.uy/descargas/curso_tb_mico_ bacterias/reaccion_en_cadena_polimerasa.pdf  http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir2013/ir132d.pdf  http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_2010_1/tec nicadepcr.pdf