Aplicaciones de la Industria del PCR en la Industria de Alimentos y Laboratorios.

1. PCR en la Industria de Alimentos

2. Objetivos
Dar a conocer la importancia del PCR en la industria de
Alimentos
Promover el auto estudio en los participantes en las técnicas de
PCR utilizadas en la detección de Patógenos de trasmisión
alimentaria.
Apropiarse de los fundamentos básicos del PCR para la mejora
de los procesos en el laboratorio.

3. Tendencia en la utilización del PCR en
la industria alimentaria como
herramienta para el diagnóstico.
• Desarrollo de metodos más rápidos y efectivos,
altamente especificos.
• Los metodos convencionales son laboriosos y llevan
demasiado tiempo.
• El éxito de la implementación de la PCR para la
identificación de microorganismos patógenos es la
elección correcta del la secuencia de ADN
diana que se quiere amplificar en la PCR.

4. PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa
PCR y Variantes Real-Time PCR
Kary Mullis (1983)

5. Que es PCR?
• La PCR es una metodología que consiste en la
amplificación enzimática en ciclos repetidos de un
fragmento específico de ADN o ARN utiliza la
enzima ADN polimerasa, a partir de pequeñas
cantidades de moléculas de ADN o ARN. Dos
oligonucleótidos son utilizados como cebadores
“Primers”. Estos son cadenas de nucleótidos que
se unen a secuencias complementarias en el
extremo 5´ de cada hebra de ADN a amplificar.

6. Pasos a realizar en una
PCR
• Obtener el ADN o material genético
• Preparación de la mezcla de la reacción .
• Agregar el Material genético a la mezcla de
reacción.
• Termociclado
• Interpretación de datos en tiempo real

7. Obtención del ADN
• Estandarizar el método de extracción de acuerdo a
la matriz.
• Para el aislamiento bacteriano, solo es necesario el
proceso de hervido. En cambio para el aislamiento
en muestras mas complejas que pueden llegar a
contener inhibidores o poca carga bacteriana, es
necesario un enriquecimiento bacteriano previo y en
algunos casos la necesidad de eliminar los
inhibidores.
• Para la realización de una simple PCR no es
necesario un ADN tan limpio y purificado, pero para
realizar una secuenciación si es necesario que este
ADN este limpio y purificado.

8. Preparación de la mezcla
de reacción
• Buffer Tris-HCl 20mM y 50nM KCl pH 8.3- 8.9. es
necesario para la adecuada actividad enzimática.
• Cloruro de Magnesio: cofactor indispensable (Taq
polimerasa) y afecta el “annealing” de los “primers“.
Los rangos de concentración utilizados son de (1 a 3)
mM.
– Altas concentraciones disminuyen la especificidad de
la reacción.
– Bajas concentraciones disminuyen la eficiencia de la
reacción.

9. • Deoxirribonucleotidos: ATP, CTP, GTP Y TTP,
(dNTps).
– Agregados en iguales proporciones para minimizar falsas
incorporaciones en la polimerización.
– Se ajusta la concentración para optimizar la especificidad y
fidelidad de la reacción. Generalmente 100 uM en el ensayo.
• Primers o cebadores:
– Preferentemente entre 15 y 30 pb de longitud.
– No deben ser complementarios entre si .
– Deben tener similar contenido de (G + C) y en baja conc. en
el extremo 3´.
– No deben contener estructuras secundarias.
– El rango de concentración en el ensayo varía desde
(0.3 a 1) uM.
• Altas concentraciones disminuyen la especificidad de la reacción.
• Bajas concentraciones disminuyen la eficiencia de amplificación.

10. • Enzima ADN polimerasa:
– Enzima Taq polimerasa.
– Tienen actividad de polimerasa y exonucleasa 5´ - 3 ´.
– Debe agregarse al final de la preparación de la
máster mix.
– El rango habitual en cada ensayo es de (0.5 – 2.5) U.
• baja concentración disminuye el rendimiento de la reacción
• altas concentraciones generan productos inespecíficos.
“ La concentración en la que se utilizan
cada uno de los reactivos va a afectar la
sensibilidad y especificidad de la
reacción”.
Todos los reactivos deben ser conservados a -20 °C.

12. PCR
Melting
94 oC
Melting
94 oC
Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Temperatura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
5’
3’ 5’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
Calor
Calor

13. PCR
Melting
94 oC
Melting
94 oC
Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Temperatura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
5’
3’ 5’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’

14. PCR
Melting
94 oC
Melting
94 oC
Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Temperatura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
5’
3’ 5’
Fragmentos de
tamaño definido
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’

15. Producción de productos inespecíficos
• Altas concentraciones de nucleótidos.
• Bajas temperaturas de annealing.
• Bajas temperaturas de extensión.

16. Principios de la PCR en tiempo real (Real
Time-PCR)
1)La Real-Time PCR detecta la acumulación del producto
durante la reacción.
2)Los datos son recolectados en la fase exponencial de la
reacción de PCR.
3)La detección y cuantificación de reporteros
fluorescentes se realiza en “tiempo real”.
4)La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de
producto de PCR.
Tipos de Sondas
1. SYBR Green
2. TaqMan

19. Se puede dividir en las técnicas basadas:
1- En fluorocromos no específicos.
2- En sondas específicas.
1- Utiliza el SYBR Green, que es un fluoróforo que se
intercala en el DNA de doble hebra. Por ende,
mientras mas DNA amplificado exista en el medio,
mas SYBR green se intercalara y la luminiscencia
aumentara proporcionalmente a los fragmentos
amplificados.
-Ventaja : Utilizar cebadores normales.
Más económica que la que usa sondas
específicas.
- Desventaja: Permite cuantificar sólo una secuencia
por reacción.

20. 2- Utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que
hibrida en la zona intermedia entre el iniciador
directo (forward) y el inverso (reverse).
Esto permite monitorizar el cambio de patrón de
fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.
- Ventaja:
• Muy Precisos y evita posibles secuencias inespecíficas.
• Permite cuantificar el ADN amplificado.
- Desventaja:
• Mas laborioso y costoso (diseño de secuencias específicas
como sondas)
.

21. Sondas Hidrolizadas (TaqMan)
reportero quencher
Actividad exonucleasa

22. Ventajas en
utilizar PCR
• Detección rápida y segura, económica y fiablede
patógenos.
• Procesamiento de grandes cantidades de muestras.
• La sensibilidad diagnóstica es muy alta, ya que se
producen varios millones de copias de la diana
seleccionada. También puede ser muy alta la
especificidad de la reacción, debida a las secuencias
nucleotídicas específicas formadas por los oligonucleótidos
(cebadores). Los cebadores están diseñados para detectar
secuencias nucleotídicas específicas en los genomas de
los agentes infecciosos diana seleccionados.
• Mayor poder discriminativo que los métodos fenotípicos.
• Detección de Factores de Virulencia
• Determinar los Perfiles Plasmídicos

23. Desventajas en
utilizar PCR
• Resultado poco satisfactorio, dando falsos negativos
por problemas de inhibición.
• Las sustancias inhibitorias pueden actuar a diferentes
niveles.
– Hemoglobina
– Lactoferrina
– Polisacaridos
– Grasas
– Proteinas
– Iones metálicos
– Sales (presentes en los protocolos de extracción).
(eliminación por preenriquecimiento).

24. • Utilizar pipetas “Calibradas” diferentes para cada área
• Descontaminación de mesadas, pipetas y quipos (con UV y/o
solución de NaCLO).
• Optimizar un método para abrir los tubos.
• Utilizar material nuevo y descartable (como lo son tips con filtro y
microtubos).
• Reactivos fraccionándolos en pequeñas alícuotas y estos que sean
de grado Biología Molecular para asegurar la pureza de ellos.
• Incluir Control Negativo ( Muestra que sea tan parecida como sea
posible pero sin la diana) 1c-/5m
• Los falsos positivos pueden deberse a:
– Contaminación cruzada.
– Contaminación por ADN proveniente del entorno.
– Contaminación por el producto amplificado.
• Los falsos negativos pueden deberse a:
– Contaminación por DNAsas. Que pueden provenir de las manos, por ello
es recomendable utilizar guantes.
– Presencia de Inhibidores.
– Errores en el pipeteo
Precauciones

25. Aplicaciones del PCR

26. Precauciones

37. La evolución del método de PCR…
Electroforesis – 1a.
Generación de PCR
Lectura multicanales
Bloque sólido 1 canal ( 2a.
Generación)
Rotor Gene 3a.
Generación

38. 7
Comparación 2a y 3a Generación
Enriq. de
muestra
Assurance GDS
2a. Generación
Enriq.
muestra
Adición
Muestra
37°C
20 min 10 min 5 min
Calentamiento
del tubo
(paso 2)
95°C
Adición de
(immunobeads)
Adición 1ml
muestra
Adición
proteasa
Adición
reactivo
para lisis
Calentamiento
del tubo
(paso 1)
Enfriamient
o tubo de
lisis
Diluye
Concentra
Add. IMB
Muestra
Vortex 10
min.
Use
Pickpen
Transfer
beads

39. GDS BAX

40. PCR de 2a y 3ra. Generación
(Sondas VS Curvas de Fusión)
PCR – Tiempo Real ( sondas) PCR con curvas de fusión
Instrumento
PCR-TR
La fluorescencia es inmediatamente
detectada y la linea aparece en la
pantalla.
La fluorescencia se acumula y después se
sube la temperatura para desnaturalizar el
DNA y la fluorecencia disminuye.
4
0

42. E. coli 0157:H7
E. coli 0157:H7 Shiga
toxins
Listeria
monocytogenes
Listeria spp.
Salmonella spp.
Ent. Sakazakii
La familia de pruebas PCR
Assurance GDS®
4
2