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- 1. N. Campillo Seva 1 Asignatura: Análisis Químico Grado: Bioquímica Curso académico: 2011/12
- 2. • 1. Generalidades: – Análisis Cualitativo y Análisis Cuantitativo • 2. Conceptos básicos en Análisis Químico • 3. Clasificación de los métodos de Análisis • 4. El proceso analítico N. Campillo Seva 2
- 3. CIENCIA DE LA MEDICIÓN: separa, identifica y cuantifica los componentes de una muestra de materia. Para ello desarrolla y mejora métodos e instrumentos QUÍMICA ANALÍTICA ANÁLISIS QUÍMICO Parte práctica de la Química Analítica que aplica los métodos de análisis para resolver problemas 1. GENERALIDADES N. Campillo Seva 3
- 4. ANÁLISIS QUÍMICO Análisis Cualitativo Análisis Cuantitativo Identificación de las especies que componen la muestra Determinación de la cantidad relativa de los componentes de la muestra en términos numéricos Glucosa, colesterol total, triglicéridos, hierro, ferritina, albúmina, acido úrico…. Glucosa 100 mg/dL Colesterol total 200 mg/dL Triglicéridos 160 mg/dL Ácido úrico 5 mg/dL Fe 150 µg/dL Ferritina 200 µg/dL Albúmina 5 g/dL Sangre N. Campillo Seva 4 F1
- 5. IMPORTANCIA DE LA QUÍMICA ANALÍTICA 5 QUÍMICA ANALÍTICA Biología Geología Ciencias Ambientales Agricultura Ciencias Sociales Ciencias de los materiales Física Medicina Ingeniería Química
- 6. 2. CONCEPTOS BÁSICOS EN ANÁLISIS QUÍMICO • MUESTRA: Parte representativa de la materia objeto de análisis. • ALÍCUOTA: Fracción o porción de muestra. • ANALITO: Especie química objeto del análisis. • MATRIZ DE LA MUESTRA: Especies químicas que acompañan al analito en la muestra. • TÉCNICA ANALÍTICA: Medio empleado para obtener información sobre el analito. • MÉTODO ANALÍTICO: Secuencia de operaciones y técnicas aplicadas para el análisis de una muestra. EJEMPLO: Análisis de glucosa en sangre. Muestra: Sangre Analito: Glucosa Matriz: Proteínas, sales minerales, colesterol… Técnica analítica: Espectrofotometría de absorción molecular visible Método analítico: Implica desde la toma de muestra hasta la obtención del resultado final. N. Campillo Seva 6
- 7. OTROS CONCEPTOS IMPORTANTES • INTERFERENTE: Especie química distinta del analito que aumenta o disminuye la respuesta del analito bajo el método aplicado. (Ej. Analito: Ca2+, Al3+ es un interferente si la determinación se lleva a cabo por valoración con EDTA. Interferencia positiva) • ENMASCARAMIENTO: Transformación del interferente en otra especie química que no es detectada con la técnica analítica empleada. (Ej. Al3+ + 3OH- → Al(OH)3) • DISOLUCIÓN ESTÁNDAR: Disolución conteniendo el analito en concentración perfectamente conocida. (Ej. Disolución acuosa conteniendo glucosa en una concentración exacta de 75 mg/dL) • CURVA DE CALIBRADO: Gráfica que representa la señal analítica monitorizada frente a la concentración del analito. N. Campillo Seva 7
- 8. 3. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS ● Métodos clásicos: se basan en propiedades químicas de los analitos. Volumetrías y gravimetrías. ● Métodos instrumentales: se basan en propiedades químico-físicas de los analitos. Se clasifican según la propiedad que se mide (espectroscópicos, electroquímicos, misceláneos…) ● Métodos de separación: la finalidad inicial de estos métodos era separar interferentes antes de proceder a aplicar la técnica analítica seleccionada. En la actualidad, existen métodos de separación que son métodos de análisis en sí mismos, como por ejemplo la cromatografía. N. Campillo Seva 8 Mediciones en Análisis Cuantitativo - Peso o volumen de muestra - Cantidad proporcional a la cantidad de analito en la muestra
- 9. El Análisis Químico alcanza sus objetivos mediante el PROCESO ANALÍTICO, que es la aplicación del método científico, implicando el proceso de la figura: Problema Elección del método analítico Toma de muestra Tratamiento de la muestra Proceso de medida Tratamiento de los datos Informe y conclusiones MÉTODO ANALÍTICO Valoración de los resultados 4. EL PROCESO ANALÍTICO N. Campillo Seva 9
- 10. ETAPAS DEL PROCESO ANALÍTICO 4.1. Definición del problema: En esta 1ª etapa se plantea el tipo de análisis requerido y la escala de trabajo. Ejemplo: Se pretende contrastar el contenido real de acido acetilsalicílico (AAS) en un producto farmacéutico con el valor suministrado por el fabricante N. Campillo Seva 10 4.2. Selección del método de análisis: Consideraciones importantes: ☺ Exactitud requerida en los resultados ☺ Disponibilidad de tiempo y de dinero ☺ Número de muestras a analizar ☺ Concentración esperada del analito en la muestra ☺ Complejidad de la muestra bajo análisis Etapa crucial para el éxito de los resultados finales Buscar en la bibliografía procedimientos apropiados o, si es necesario, poner a punto nuevos procedimientos analíticos para llevar a cabo el análisis Volumetría ácido-base AAS NaOH F1 F2
- 11. 4.3. Toma de muestra o muestreo • Plan de muestreo: estrategia a seguir para garantizar que los resultados obtenidos reflejen la realidad del material analizado. • Características que ha de cumplir la muestra: – ser representativa del material a analizar – ser homogénea, lo que significa que debe ser igual en todas sus partes. Se reduce el error en los resultados N. Campillo Seva 11 F1
- 12. 4.4. Tratamiento de la muestra Son escasos los problemas que se resuelven sin necesidad de tratamiento de la muestra 2. Eliminar interferencias matriciales Lo habitual, es que la muestra necesite algún tipo de tratamiento, con el fin de: 1. Preparar la forma y tamaño de la muestra, así como la concentración del analito(s), más adecuada para la técnica analítica seleccionada N. Campillo Seva 12
- 13. Consideraciones importantes durante la etapa de preparación de muestra 1) La preparación de la muestra no puede implicar pérdidas de analito, ni tampoco contaminaciones. 3) Si es necesario, se eliminarán las interferencias de la matriz, mejorando así la selectividad del método. 4) No se deben introducir nuevas interferencias. 5) Debe considerarse la dilución o preconcentración del analito, de manera que se halle en el intervalo de linealidad del método seleccionado. 2) Se debe transformar el analito en la mejor forma química para el método analítico seleccionado. N. Campillo Seva 13
- 14. Molienda: Disminución tamaño de partícula Si la muestra es sólida Almacenamiento: luz, T, tipo de recipientes… “Liofilización previa” Si la muestra es líquida Evaporación del disolvente Si el analito es un gas disuelto en un líquido Doble recipiente sellado para su almacenamiento Si el análisis no va a ser inmediato La mayoría de las técnicas analíticas: MUESTRA EN ESTADO LÍQUIDO N. Campillo Seva 14 F1 F3 F2 F4 F5 Mortero Maza
- 15. Elección del método Obtención de la muestra Preparación de la muestra ¿Se encuentra el analito disuelto? Sí ¿Es mensurable la propiedad analítica? No Extracción del analito a una fase líquida MUESTRA EN ESTADO LÍQUIDO Recogemos el líquido el sobrenadante Líquido sobrenadante N. Campillo Seva 15 Disolvente (H2O, EtOH, MeOH… Muestra sólida Agitación Suspensión del sólido en el disolvente Centrifugación Residuo sólido Residuo sólido Decantación F1
- 16. Para la determinación de AAS en producto farmacéutico mediante volumetría ácido-base - En ocasiones, se requieren condiciones más enérgicas para la extracción del analito a la fase líquida: Disoluciones acuosas de: - ácidos fuertes - bases fuertes - agentes oxidantes - agentes reductores - combinaciones de reactivos Aplicación de energía externa: - microondas - ultrasonidos… Trituración del fármaco y disolución en etanol N. Campillo Seva 16 F2 F1 F3 F4 F5
- 17. Elección del método Obtención de la muestra Preparación de la muestra ¿Se encuentra el analito disuelto? Sí ¿Es mensurable la propiedad analítica? No Extracción del analito a la fase líquida Sí No Cambio de la forma química del analito Eliminar interferencias si las hubiere Ej. Sulfonamida Adicionamos reactivos (para la determinación mediante fluorimetría) Especie fluorescente MÉTODOS DE SEPARACIÓN N. Campillo Seva 17
- 18. DEFINICIÓN DE RÉPLICAS DE MUESTRAS El proceso de medida debe llevarse a cabo en varias alícuotas idénticas de la muestra 1 mL 110 mg/dL 1 mL 109,6 mg/dL 1 mL 187,5 mg/dL 1mL 110,3 mg/dL Finalidad 1. Establecer la variabilidad del análisis 2. Evitar un error grave LA INCERTIDUMBRE ES TAN IMPORTANTE COMO LA MEDIDA MISMA X ± SD N. Campillo Seva 18 F1 F2
- 19. 4.5. Proceso de medida La mayoría de los métodos necesitan de disoluciones estándar o patrón VOLUMETRÍAS: Se mide la cantidad de equivalentes químicos de valorante en el punto final de la valoración Señal analítica = K x CA K= constante de proporcionalidad CA= concentración de analito Disolución patrón CA = 80 mg/dL S = 0,199 0,199 = K 80 K = 0,0025 dL/mg Disolución problema CA = ? S = 0,261 0,261 = 0,0025 CA CA = 104,4 mg/dL N. Campillo Seva 19 F1 F2
- 20. 4.6. Tratamiento de los datos a través de ecuaciones de calibración Concentración, mg/dl Señal analítica 0 0,001 40 0,101 80 0,199 120 0,303 160 0,401 200 0,498 Señal analítica = ordenada origen + K x CA Señal analítica = 0,00129 + 0,0024 x CA Concentración, ppm 0 50 100 150 200 250 Señal analítica 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 mg/dl Curva de calibración con patrones externos N. Campillo Seva 20
- 21. Concentración, ppm 0 50 100 150 200 250 Señal analítica 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Señal analítica = 0,0013 + 0,0024 x CA 0,261 = 0,0013 + 0,0024 x CA CA = 108,2 mg/dL mg/dl N. Campillo Seva 21 CÁLCULO DE CA EN LA MUESTRA A TRAVÉS DE LA CURVA DE CALIBRADO Aplicación de factores de dilución ó preconcentración, si procede El método de calibración frente a patrones externos es válido si una determinada CA tanto en la muestra como en la disolución estándar proporciona la misma respuesta analítica.
- 22. 22 Si las respuestas analíticas para un mismo valor de CA en la disolución estándar y en la muestra son diferentes: Método del estándar interno Método de adiciones estándar El patrón interno es una especie de referencia (R), con propiedades químicas y físicas parecidas a las del analito (A) SA/SR CA CA añadida a la muestra SA Se agregan cantidades conocidas de analito a la muestra Concentración de analito en la muestra
- 23. 4.7. Evaluación de los resultados, informe y conclusiones El informe dirigido al solicitante del análisis ha de: 1. Indicar claramente los resultados 2. Las condiciones experimentales empleadas 3. Limitaciones concretas de la técnica analítica empleada 1. Concentración de glucosa obtenida: x ± SD 1. Técnica espectrofotométrica … 2. Intervalo de linealidad, LD, LQ… As en orina 1. ND (no detectado) 2. Espectrometría de absórción atómica con atomización electrotérmica (ETAAS) 3. LD (Límite de detección): 50 ppt N. Campillo Seva 23 Los resultados han de ser evaluados por estimación de su fiabilidad
- 24. El analista puede o no implicarse en lo que se vaya a hacer con su información. Como mínimo debería asegurarse que las conclusiones que se extraigan de sus datos sean coherentes con los mismos. 1. Concentración de glucosa: 520 ± 1 mg/dL 1. Técnica espectrofotométrica … 2. Intervalo de linealidad, LD, LQ… Ingreso hospitalario del individuo 1. Concentración de As en orina: 403 ± 2 ng/L 2. Técnica HG-AAS 3. Intervalo de linealidad, LD, LQ… Envenenamiento crónico del individuo N. Campillo Seva 24 Conclusiones
- 25. Elección del método Obtención de la muestra Preparación de la muestra ¿Se encuentra el analito disuelto? Sí ¿Es mensurable la propiedad analítica? No Extracción del analito a la fase líquida Sí No Cambio de la forma química del analito Eliminar interferencias si las hubiere Medir la propiedad analítica Calcular los resultados Informe Conclusiones Estimar la fiabilidad de los resultados N. Campillo Seva 25
- 26. CRÉDITOS DE LAS ILUSTRACIONES – PICTURES COPYRIGHTS -Logo Portada OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia. Dirección web: http://ocw.um.es. -Página 5, F1. Dirección web: http://blogdelcancer.blogspot.com/ -Página 10, F1. Autor: Mysid (original by Quantockgoblin). Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:burette.svg -Página 10, F2. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chemistry_flask_matthew_02.svg -Página 11, F1. Dirección web: http://maikelnai.elcomercio.es/wp-content/uploads/2008/04/farmaco_radiacion.jpg -Página 14, F1. Fuente: “Quantitative Chemical Analysis”, Seventh Edition, © 2007 W.H. Freeman and Company. -Página 14, F2. Dirección web: http://profesores.elo.utfsm.cl/~agv/elo323/2s06/projects/GerardoAlvarez/proyecto_final_archivos/image009.gif -Página 14, F3. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Eppendorf_tubes.jpg -Página 14, F4. Dirección web: http://www.sunbox.es/es/envases-industriales-3/botes-5/frascos-roscados-111.html -Página 14, F5. Dirección web: http://www.adendorf.net/ -Página 15, F1. Fuente: “Quantitative Chemical Analysis”, Seventh Edition, © 2007 W.H. Freeman and Company. -Página 16, F1. Autor: Hannes Grobe. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Mortar_achat_hg.jpg -Página 16, F2. Autor. User:Ruhrfisch. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Magnetic_Stirrer.JPG -Página 16, F3. Autor: Hannes Grobe. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Volumetric_flask_hg.jpg -Página 16, F4. Dirección web: http://www.inilab.es/media/catalog/product/cache/1/small_image/160x/9df78eab33525d08d6e5fb8d27136e95/2/2/22001.png -Página 16, F5. Dirección web: http://www.icb.csic.es/fileadmin/grupos/ProcesosQuimicosAvanzados/HornoDeMicroondas-m.jpg -Página 18, F1. Dirección web: http://newsimg.bbc.co.uk/media/images/41203000/jpg/_41203257_050531vihbody.jpg -Página 18, F2. Dirección web: http://us.cdn3.123rf.com/168nwm/dusanzidar/dusanzidar0801/dusanzidar080100075/2443753-parte-la- celebraci-n-de-sangre-en-tubo-de-ensayo-cerca.jpg -Página 19, F1 y F2. Fuente: “Quantitative Chemical Analysis”, Seventh Edition, © 2007 W.H. Freeman and Company. N. Campillo Seva 26
Notas del editor
- Este tema aporta una revisión panorámica de qué es el Análisis Químico, sus distintas vertientes y su terminología básica. La importancia de la Química Analítica queda plasmada a través de sus aplicaciones en todos los campos de la ciencia. Los pasos generales implicados en un análisis cuantitativo se revisan de forma exhaustiva mostrando la importancia de la Química Analítica para la resolución de problemas de diversos ámbitos.
- Se puede definir la “Química Analítica” como una ciencia de la medición basada en un conjunto de ideas y métodos útiles en todos los campos de la ciencia. La Química Analítica se ocupa de separar, identificar y determinar la composición relativa de cualquier muestra de materia. Se considera al “Análisis Químico” como la parte práctica de la “Química Analítica” que aplica los métodos desarrollados por la misma para la resolución de problemas.
- El Análisis Químico de una muestra de materia puede abordarse desde dos puntos de vista: El análisis cualitativo establece la identidad química de las especies en la muestra. El análisis cuantitativo determina en forma numérica la cantidad relativa de las especies que componen la muestra.
- La Química Analítica ha jugado un papel fundamental en el desarrollo de la ciencia. Su gran importancia ha propiciado que sea cultivada de forma asidua desde los inicios de la historia de la Química. La relación de la Química Analítica no se reduce simplemente a otras ramas de la Química, sino a otras muchas ciencias, por lo que es frecuente que se la califique como “Ciencia Central”.
- Resulta conveniente antes de adentrarnos en el Análisis Químico definir los términos más frecuentemente empleados en este ámbito: muestra, alícuota, analito, matriz de la muestra, técnica analítica y método analítico.
- Rara vez un método de análisis es específico, en el mejor de los casos será selectivo. Por esta razón es muy común la aparición de especies interferentes durante un análisis, siendo el enmascaramiento es una vía comúnmente empleada para eliminar interferencias, mediante la cual la especie interferente es transformada en otra especie química que no altera la respuesta del analito. La mayor parte de los métodos analíticos son relativos, es decir el contenido de analito en la muestra se obtiene a través de un patrón de referencia, denominándose disolución patrón o estándar a una disolución de concentración exactamente conocida. La gráfica que representa la respuesta analítica en función de la concentración del analito correspondiente se llama curva de calibrado o curva estándar.
- Para llevar a cabo un análisis cuantitativo hay que llevar a cabo dos mediciones: La primera corresponde al peso o volumen de la muestra bajo análisis. La segunda medida es una cantidad que es proporcional a la cantidad de analito que hay en la muestra. Los métodos analíticos se clasifican en función de la naturaleza de esta última medida: Métodos clásicos: Llamados de este modo por ser los primeros que cronológicamente se desarrollaron en el ámbito del Análisis Químico. Implican la medida de una propiedad química del analito o alguna especie relacionada con el mismo. En los métodos gravimétricos se determina la masa de analito o de algún compuesto relacionado químicamente con el analito. En los métodos volumétricos se mide el volumen de una disolución de concentración conocida que contiene la cantidad de reactivo necesaria para reaccionar completamente con el analito. Métodos Instrumentales: Los métodos electroanalíticos conllevan la medida de alguna propiedad eléctrica como potencial, intensidad de corriente, conductividad eléctrica o cantidad de electricidad. Los métodos espectrofotométricos se basan en la medida de alguna propiedad de la radiación electromagnética tras la interacción con los átomos o moléculas de analito; o bien la producción de radiación electromagnética a partir del analito cuando la materia ha sido sometida a algún tipo de excitación. Existe un grupo misceláneo de métodos instrumentales que implican la medida de la relación carga-masa, velocidad de desintegración radioactiva, calor de reacción, conductividad térmica, actividad óptica o índice de refracción. Métodos de separación: la finalidad inicial de estos métodos en un principio fue la eliminación de interferentes antes de proceder a aplicar la técnica analítica seleccionada. En la actualidad, existen métodos de separación que son métodos de análisis en sí mismos, como por ejemplo la cromatografía.
- Un análisis cuantitativo implica una secuencia de etapas que se detallan en la figura. En algunos casos, es posible omitir una o más etapas; por ejemplo, si la muestra se encuentra en el estado físico y condiciones adecuadas para ser analizada mediante la técnica seleccionada, es posible que no se requiera ningún tratamiento previo de la misma. En las siguientes diapositivas se detallan cada uno de los pasos del proceso analítico.
- La primera etapa del proceso analítico se denomina “Definición del problema”, en ella se plantea el tipo de análisis requerido y la escala de trabajo, convirtiendo así las cuestiones generales en cuestiones específicas que puedan responderse a través de medidas. La segunda etapa del proceso analítico es la selección del método de análisis. Esta etapa resulta fundamental para el éxito del proceso analítico global, en ocasiones puede ser la etapa más difícil, requiriendo algo de experiencia e intuición. La selección del método de análisis generalmente representa un compromiso entre: exactitud requerida, concentración prevista del analito en la muestra, disponibilidad de tiempo, factor económico, complejidad de la muestra y número de muestras bajo análisis, entre otros factores.
- El siguiente paso del análisis cuantitativo es la obtención de la muestra. Para que la información finalmente obtenida sea significativa, es necesario que la muestra tenga la misma composición que el resto del material del que se obtuvo. Cuando este material es de gran tamaño y heterogéneo, la obtención de una muestra representativa no es fácil. Supongamos un vagón cargado con 25 toneladas de arroz, del que se sospecha un contenido de arsénico superior al legislado. La toma de muestra requiere un plan adecuado, con el fin de conseguir una pequeña masa del material cuya composición represente con exactitud a la totalidad del material muestreado. La obtención de muestras de carácter biológico representa otro tipo de problema de muestreo. La complejidad de los sistemas biológicos y la influencia del modo de toma de muestra sobre los resultados obtenidos han propiciado el desarrollo de procedimientos estrictos de muestreo y transporte de muestras a los laboratorios clínicos, con el fin de obtener muestras representativas y mantener su integridad. En realidad, los problemas de muestreo suelen ser menores que en estos casos. Sea cual sea la complejidad de la materia a analizar, la muestra ha de representar la totalidad de dicha materia y ha de presentar carácter homogéneo.
- Son escasos los problemas que se resuelven sin necesidad de tratamiento de la muestra antes de proceder a la medida; por ejemplo, la medida del pH de una muestra de agua de río puede llevarse a cabo directamente sin tratamiento alguno de la muestra. Sin embargo, lo más habitual es que la muestra necesite algún tipo de tratamiento, con el fin de: Preparar su forma y tamaño, así como la concentración del analito(s), dentro de los intervalos más adecuados para la técnica analítica seleccionada. Además la eliminación de interferentes de la matriz de la muestra es obligatoria en muchos casos.
- La etapa de tratamiento de la muestra ha de llevarse a cabo teniendo en cuenta cinco consideraciones importantes: 1. Han de evitarse pérdidas de analito y/o contaminaciones. 2. El analito será transformado a la forma química más adecuada para el método analítico seleccionado. Por ejemplo, la determinación de manganeso mediante espectrofotometría de absorción molecular en el visible requerirá su transformación a MnO4-. 3. Si es necesario, se eliminarán las interferencias de la matriz, con el fin de incrementar la selectividad del método. 3. Por supuesto, resulta totalmente inadmisible la introducción de nuevas interferencias. 4. Debe considerarse la dilución o preconcentración del analito, de manera que éste se encuentre en el intervalo de linealidad del método seleccionado.
- La mayoría de los análisis se llevan a cabo en disoluciones de la muestra preparada en un disolvente adecuado. Si la muestra es sólida, se procede a su trituración para disminuir el tamaño de partícula, se mezcla para garantizar su homogeneidad y se almacena en condiciones adecuadas, si el análisis no se va a llevar a cabo de inmediato. En el caso en que la muestra sea líquida y no vaya a analizarse tras su recogida, por supuesto las condiciones de almacenamiento han de considerarse; por ejemplo, si se mantienen en recipientes abiertos, el disolvente podría evaporarse modificando así la concentración del analito. En el caso de que el analito fuese un gas disuelto, el recipiente de la muestra debe estar en un segundo recipiente sellado para impedir contaminación por gases atmosféricos.
- Si el analito se encuentra disuelto y en la forma química adecuada, puede procederse a la etapa de medida. Sin embargo, si el analito no se encuentra disuelto, será necesaria su disolución en el disolvente adecuado. En determinadas ocasiones es suficiente con poner en contacto el disolvente (agua, disolución reguladora, etanol…) con la muestra sólida y, tras la centrifugación de la mezcla, recoger el líquido sobrenadante conteniendo el analito.
- Veamos como ejemplo la determinación de ácido acetilsalicílico en un preparado farmacéutico mediante un método volumétrico, determinación que se lleva a cabo en una práctica de laboratorio propuesta en la presente asignatura. En este caso la muestra sólida se tritura y su disolución en etanol permite la transferencia del analito a la fase acuosa. Sin embargo, en muchas ocasiones esta etapa de disolución no resulta tan sencilla y es necesario emplear disolventes más fuertes (ácidos, bases, agentes oxidantes…) e incluso la aplicación de energía externa a través de sistemas de microondas, ultrasonidos, etc.
- Una vez que el analito se encuentra en fase líquida, la siguiente cuestión es conocer si se encuentra en la forma química adecuada para llevar a cabo la medida de la propiedad analítica. Por ejemplo, si se quiere determinar sulfonamidas mediante espectrofluorimetría, es claro que será necesario someter al analito a una reacción química que lo transforme en una especie fluorescente, ya que dichos compuestos no son fluorescentes de per se. La eliminación de interferencias se considera como parte de la preparación de la muestra y resulta indispensable antes de proceder a la etapa de medida, para ello se recurrirá al método de separación más adecuado. No se cuentan con reglas generales para la eliminación de interferencias.
- La mayoría de los análisis químicos se llevan a cabo sobre varias réplicas de la muestra, cuyas masas o volúmenes se determinan con mediciones cuidadosas a través de balanzas analíticas o material volumétrico de precisión. El análisis de réplicas mejora la calidad de los resultados e informa acerca de la fiabilidad del análisis. Las medidas cuantitativas de réplicas de muestras se suelen promediar y luego se aplican diversas pruebas estadísticas a los resultados para establecer la fiabilidad y descartar datos atípicos, si los hubiera.
- El proceso de medida puede considerarse la quinta etapa del proceso analítico. Todos los resultados analíticos dependen de la medida final de una propiedad física o química del analito. Las valoraciones o titulaciones se encuentran entre los métodos analíticos más precisos, ocupando una parte importante del programa de esta asignatura. En una valoración, el analito reacciona con un reactivo estandarizado mediante una reacción de estequiometria conocida. La cantidad de reactivo estandarizado necesario para alcanzar la condición de equivalencia se relaciona con la cantidad de analito presente. Por tanto, la valoración es un tipo de comparación química. En la calibración con un estándar externo, la muestra se prepara por separado del estándar. La propiedad analítica medida (S) depende de manera conocida y reproducible de la concentración del analito (CA). En teoría, la medida de la propiedad es directamente proporcional a la concentración: S = K x CA. Salvo dos excepciones, todos los métodos instrumentales requieren la determinación empírica de K con estándares o patrones del analito. La determinación del valor de K se denomina calibración. En una primera aproximación es posible obtener el valor de K con el uso de un único estándar externo y seguidamente calcular el contenido de analito en la muestra problema. Generalmente resulta más seguro trabajar no con una única disolución patrón sino con varias, como vemos en la siguiente diapositiva.
- Los estándares externos se usan para calibrar instrumentos y procedimientos cuando no hay efectos de interferencias de los componentes de la matriz en la disolución del analito. Se preparan una serie de estándares externos de distintas concentraciones conocidas del analito. Idealmente se utilizan tres o más disoluciones en el proceso de calibración. La calibración con un único patrón, que sería la propuesta en la diapositiva anterior, no es recomendable pues conlleva un alto riesgo de error. La calibración se lleva a cabo al obtener la señal de respuesta (altura o área de pico, absorbancia, voltaje, etc.) como función de la concentración conocida del analito. Al representar gráficamente los datos y ajustarlos a una ecuación matemática se obtiene la curva de calibrado. El método de mínimos cuadrados es el método de análisis de regresión más empleado para datos bidimensionales. La constante de proporcionalidad (K) corresponde a la pendiente de calibración.
- Seguidamente la señal analítica obtenida para la muestra analizada se sustituye en la ecuación de calibración obteniéndose la concentración del analito. Los factores de dilución o precocentración a los que hubiese sido sometida la muestra antes del proceso de medida, habrán de ser considerados para la obtención del resultado final. Cuando se emplean estándares externos, se supone que cuando el analito se halle en la muestra y en la disolución estándar en la misma concentración, se obtendrá la misma respuesta. Sin embargo, esto no siempre ocurre así y, en esos casos, es necesario recurrir a otros métodos de calibración como el del estándar interno o el de adiciones estándar a las muestras.
- En el método del estándar interno se agrega a las muestras, estándares y blancos una cantidad conocida de una especie de referencia, que será seleccionada de forma que tenga propiedades físicas y químicas semejantes a las del analito. La señal de respuesta es la relación entre la señal del analito y la de la especie de referencia (representada en el eje de ordenadas). En el eje x se representa la concentración del analito en las disoluciones estándar. Este método puede compensar cierto tipo de errores, si éstos influyen en el analito y la especie de referencia en la misma proporción. El método de adiciones estándar a las muestras se usa cuando es difícil o imposible duplicar la matriz de la muestra. Se adiciona a la muestra una cantidad o cantidades conocidas de una disolución estándar del analito. En el método de un solo punto, se toman dos porciones de muestra: una se mide como de costumbre, y a la otra se le agrega una cantidad conocida del analito. Ambas respuestas se utilizan para calcular la concentración de analito en la muestra. En el método de adiciones múltiples, a varias alícuotas de muestra se le agregan cantidades conocidas de la disolución estándar del analito y se obtiene la curva de calibración de adiciones múltiples. El valor absoluto del punto de corte de la recta obtenida con el eje de abcisas corresponderá a la concentración de analito en la muestra sometida al proceso de medida.
- Los resultados analíticos se consideran incompletos sin una estimación de su fiabilidad. Por tanto, debe proporcionarse alguna medición de la incertidumbre relacionada con los cálculos obtenidos si pretendemos que los resultados tengan valor. Además, el informe final no sólo debe plasmar los resultados obtenidos sino también las limitaciones concretas del método de análisis empleado: intervalo de linealidad, límite de detección, límite de cuantificación, etc. En cualquier caso, el informe puede ir dirigido a un especialista o para el público en general, de modo que será necesario asegurarse de que es apropiado para el destinatario previsto.
- Una vez escrito el informe, el analista puede o no estar implicado en el uso de su información. Como mínimo el analista tiene la responsabilidad de asegurar que las conclusiones que se extraigan de sus datos sean coherentes con los mismos.
- A modo de resumen, se muestra en la diapositiva los principales pasos del proceso analítico a partir de la elección del método de análisis.