Este documento presenta una introducción a la biotecnología moderna y la ingeniería genética. Explica los tres pasos clave para transformar un organismo: 1) aislar el gen de interés, 2) colocarlo en un vector de ADN recombinante, y 3) transferir el ADN al genoma del organismo objetivo. También describe cómo se usa Agrobacterium tumefaciens para transferir genes a plantas y crear papas transgénicas resistentes a plagas. Finalmente, detalla métodos para caracterizar y evaluar plantas modificadas

1. Bases de la biotecnología moderna
SEMINARIO - TALLER
EVALUACION Y GESTION DE RIESGO DE
ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS
Lima, 28 de Septiembre - 1° de Octubre, 2004
Jorge Benavides
Laboratorio de Biotecnología Aplicada
Centro Internacional de la Papa (CIP)
www.cipotato.org
www.potatoGENE.org

2. El rol de los cultivos transgénicos
La ingeniería genética o transgenesis en el
mejoramiento genético es una nueva técnica aplicada
a una antigua metodología: el movimiento de los
genes
• Agricultura empezó 10,000
• Mejoramiento genético clásico: >100 años desde
Mendel. Nuevas variedades son producidas por
selección en progenies obtenidas por cruzamientos
• Mejoramiento por ingeniería genética: >10 años.
Nuevas variedades son producidas por inserción de
genes seleccionados en variedades existentes pero
que carecen de la característica agregada

3. Domesticaci
Domesticació
ón del
n del Maíz
Maíz
Número de mutaciones
Efecto de
las
mutaciones
refinamiento
domesticación

4. Resultados de cruzamiento
natural
• Domesticación del cultivo.
• Mejorar las características para aumentar la
producción y calidad del grano de maíz.
• La modificación genética natural entre especie se da
por:
– Rearreglos de los genes dentro de una especie en forma
natural o por polinization dirigida
– Incorporación de genes a partir de especies silvestres o
cercanas relacionadas por polinización

5. Límites del mejoramiento
convencional
• Proceso lento para desarrollar nuevas
variedades.
– Por lo menos 10 años utilizando técnicas de
mejoramiento convencional.
• Característica deseada nueva y mejorada no
siempre estan presentes en las especies.
– Resistencia a insectos y enfermedades
– Mejoramiento fisiológico
– Tolerancia al Stress
– Compuestos deseable en la planta

6. Mejoramiento por radiación

7. La ingeniería genética es:
Tecnología del ADN recombinante y otras que
contribuyen a la modificación genética de los
organismos y moléculas de ADN para obtener
rasgos específicos mediante la modificación
y/o la transferencia de los genes.

8. Ingeniería Genética
• Permite desarrollar más rápidamente
variedades.
– Cultivo de Tejidos, DNA recombinante, etc.
• Permite transferir caracteres genéticos
de una variedad no relacionada a otra.
– e.g., resistencia a insect resistance
originadas a partir de Bt bacteria.

9. Mejoramiento tradicional vs.
Biotecnología

10. La ingeniería genética es:
Según la Ley 27104
“Tecnología del ADN recombinante, aplicada para modificar
deliberadamente propiedades genéticas de las células vivas
con el fin de hacerlas producir nuevas sustancias o
conferirles nuevas o superiores funciones.
Proceso mediante el cual se transfiere el gen de un organismo
a otro a través de la manipulación de la información genética
(genes).”

11. La ingeniería genética es:
Según el Protocolo de Cartagena
“ Por organismo vivo modificado se entiende cualquier organismo
vivo que posea una combinación nueva de material genético
que se haya obtenido mediante la aplicación de la biotecnología
moderna.
Por biotecnología moderna se entiende la aplicación de:
- técnicas in vitro de ácido nucleico, incluidos el ácido
desoxirribonucleico (ADN) recombinante y la inyección directa
de ácido nucleico en células u orgánulos, o
- la fusión de células mas allá de la familia taxonómica, que
superan las barreras fisiológicas naturales de la reproducción o
de la recombinación y que no son técnicas utilizadas en la
reproducción y selección tradicional.”

12. La ingeniería genética es:
• La fusión somática no es una técnica derivada de la
ingeniería genética.
• Se puede modificar los genes sin introducir ADN
foráneo (mutación, edición de los genes)
• Todos los organismos vivos son modificados de
alguna forma por el hombre (selección) y por el
ambiente (mutaciones).
El concepto de OVM en el marco del Convenio
sobre la biodiversidad y el Protocolo de
Cartagena refleja una percepción publica mas
que un concepto científico.

13. Transformación genética
Cómo es que una planta
transformada expresa un gen
particular para ganar nuevas
características?

14. El ADN
James Watson
& Francis Crick
1953

15. Transformación genética
Tres pasos principales para transformar un
organismo:
1. Aislar el pedazo de ADN de interés (gen) a partir
de un genoma de un organismo
2. Ubicar el ADN aislado en un vector especial,
produciendo un ADN recombinante
3. El Vector es luego usado para transferir el
pedazo de ADN hacia el genoma de un segundo
organismo (planta).

16. Plásmido
Bacteria
-DNA extracromosómico
-DNA circular, pequeño
-Contiene pocos genes incluyendo
los genes de resistencia a
antibioticos
Los plásmidos pueden replicarse
por sí mismos y han sido modificados
para servir como Vectores.
Cromosoma
bacteriano

17. Transformación genética
Uno de los varios sitios
donde un gen foráneo
puede ser insertado
Gen para
resistencia a
antibioticos
Un plásmido vector
Origen de replicación - una secuencia particular
de ADN que permite replicarse en una bacteria
particular

18. Aislamiento del gen Bt

19. Aislamiento del gen Bt
Gen del Bt
Enzimas de
Restricción
DNA de Bacillus thuringiensis

20. El ADN recombinante
5’ GTGCCGGTTGAATTCCGCGATCGTAAAC 3’
3’ CACGGCCAACTTAAGGCGCTAGCATTTG 5’
EcoRI
Corte con enzimas de restricciones
ADN de
plásmido
CCGCGATCGTAAAC 3’
TTAAGGCGCTAGCATTTG 5’
5’ GTGCCGGTTGAATT
3’ CACGGCCAAC
Paul Berg
1972
ADN del
virus SV40
5’ GTGCCGGTTGAATT
3’ CACGGCCAAC
CCGCGATCGTAAAC 3’
TTAAGGCGCTAGCATTTG 5’
Re-unificación por enzima de ligación
ADN
recombinante
5’ GTGCCGGTTGAATTCCGCGATCGTAAAC 3’
3’ CACGGCCAACTTAAGGCGCTAGCATTTG 5’

21. Clonamiento en el plásmido vector
Gen del Bt
Plásmido

22. Ligate the Bt-toxin gene into the plasmid DNA
Plasmido
Gen del Bt
=DNA ligasa

23. Transformación genética
Un gen foráneo
insertado
Gen para
resistencia a
antibioticos
Origen de replicación
Un plásmido vector con
un gen foraneo
insertado (Un ADN
recombinante)
DNA Recombinante

24. Move the plasmid + Bt-toxin DNA into E. coli
Plásmido
Gen del Bt
E. Coli

25. Inserción del gen en el
genoma de la planta

26. Tumor agalla de la corona

27. Agrobacterium es:
Š microorganism de
suelo
Š patogeno vegetal
que causa la
enfermedad agalla
de la corona plantas
leñosas

28. Introducción de nuevos
genes en plantas
Se usa el proceso natural de transferencia de genes de
una bacteria, Agrobacterium tumefaciens, a células
vegetales.

29. Plásmido Ti (pTi) Controla la
Patogenicidad en Agrobacterium
• T-DNA, es transferido al
genome de la planta
– genes inductor de Tumor
(auxinas, citokininas)
– genes de síntesis de
Opinas
• tra – conjugación
bacteriana
• Catabolismo de Opine
• genes Vir
pTI
~200 kb
T-DNA
tra
catabolismo
Opine
genes vir
ori

30. Construcción del Vector
ori
T-DNA
Eliminar genes
catabolismo opinas
Eliminar tra
Eliminar genes
auxina y citokininas
vir genes

31. El gen
Secuencia
promotor ATG
Secuencia codificante
de la proteína
Secuencia
terminador
TAA
Humano (1n) :
3,342,501,213 pb 26,000 genes
Arroz (1n)
363,357,896 pb hasta 50,000 genes
Tienen muchos genes en común.

32. C
Construc
onstrucción
ción de
de Gen
Gen
Herramientas disponibles en el CIP:
• Vectores de transformación de plantas : pBI121, pBin19,
pMOG800
• Marcadores de selección de plantas transformadas
•Elementos geneticos para expresion de genes customize :
Coding sequence
Promoters
KmR
PNos 3’Nos
RB LB
Sm
Sm/Spec
/Spec
bla
bla ori
ori tet
tet
Terminator
Signal sequence
Ubi3 = constitutive (= 35s)
GBSS = tuber
β-amylase = root
grp1.8 = xylem
gst1, wun1, mas,
… = stress-specific

33. Kmr
NPTII
Gln 35-S
promoter
OCS pA
pA7
(3.49Kb)
Apr
35-S
Promoter
OCS pA
Gln Apr
pGln-3
(5.23Kb)
p1Ax1
(10.9Kb)
Apr
Gln
Apr
pUC19
(2.68Kb)
Apr
Subcloning of
PstI-SphI
Deletion of
HindIII fragment
Fragment
EcoRI-SphI
Fragment
SphI-MboI
Ligation with
pUC19 EcoRI-BamHI
Fragment
XbaI-PstI
Fragments
EcoRI-XbaI, and
PstI-HindII
Ligation with pMOG800
digested with EcoRI-HindII
pGln-2
(6.5kb)
pGln-1
(5.05kb)
Apr
pCIP10
pCIP10
Construcción del gen de
Glutenina de trigo
Investigación en la
calidad de la hatina de
camote

34. Un ejemplo: la papa Bt
Plantas in vitro
ADN
genómico
vegetal
Agrobacterium tumefaciens
ADN de
plásmido con
el gen Bt

35. Un ejemplo: la papa Bt
Aislamiento de explantes de hojas
Formación de heridas
Infección del tejido herido por la bacteria

36. Un ejemplo: la papa Bt

37. Un ejemplo: la papa Bt

38. Un ejemplo: la papa Bt
Propagación de plántulas transgénicas
ADN genómico
vegetal con el gen
Bt incorporado

39. Un ejemplo: la papa Bt

40. Un ejemplo: la papa Bt

41. Un ejemplo: la papa Bt

42. Un ejemplo: la papa Bt

43. Un ejemplo: la papa Bt
Resistencia a plaga del
tubérculo (Polilla)
Papa Bt
Désirée
Revolución
Perricholi
Y otras
Estudio de la morfología
Invernadero de
bioseguridad,
Lima
Estudio en campo
aislado
Estación
experimental
CIP San
Ramón

44. Métodos de tansformación
Embriogénesis somática
Organogénesis directa

45. Testar OVM
• Pruebas de ELISA y PCR
estan disponibles
• Pruebas son sensibles y pueden
ser rápidas, fáciles de usar y
relativamente baratos
• Cada pocillo puede ser una
muestra

46. Polymerase
Polymerase Chain Reaction
Chain Reaction
SPECIMEN
PREP
AMPLIFICATION DETECTION
1 - 4 hours 1.5 - 3.5 hours 1 - 2 hours
Courtesy Cepheid, Inc
Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR
Extracción ADN
4 horas 2.5 – 3.5 horas 1-2 horas
AMPLIFICACION DETECCION

47. Caracterización molecular
del OVM vegetal (PCR)

48. PCR Inversa
clonación DNA
Secuenciamiento
del ADN
Localization
in plant genome
Ligación
Digestión
GenBank
Southern blotting
Amplificación PCR

49. Presencia del gen Bt en el genoma
de plantas transgénicas (Southern
blot)

50. Presencia del gen Bt en el genoma
de plantas transgénicas (Southern
blot)

51. C LT-8
1 to 19 Bt- LT-8
20 Control
• Cuantificación de Proteína
LT-8 /Bt-1 /DST 24-2 5.64
LT-8 /Bt-1 /DST 24-3 2.50
LT-8 /Bt-1 /DST 34-1 1.99
LT-8 /Bt-1 /DST 34-2 4.86
LT-8 /Bt-1 /DST 34-3 6.26
LT-8 /Bt-1 /DST 34-5 3.55
Sangema /Bt-1 / DST 39-1 2.28
Sangema /Bt-1 / DST 39-2 1.94
Sangema /Bt-1 / DST 39-3 4.71
(2 rep. ng / mg soluble proteins)
C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Presencia del gen Bt en el genoma
de plantas transgénicas (Southern
blot) y su expresion

52. Transformación genética (Biolística)

53. Transformación genética (Biolística)

54. Transformación genética
Métodos de transformación
Biolística (21%)

55. Evaluación de riesgos

56. MUCHAS GRACIAS