Presentación realizada en colaboración con mis compañeros Lemia Mohatar, Alberto Torcello, Francisco José Jiménez y Patricio Gabarrón sobre técnicas para la reprogramación celular.

1. Células Madre
Alberto Torcello
Lemia Mohatar
Patricio Gabarrón
Francisco Jiménez
Rafael Diego Macho
- 3º Grado en Bioquímica (2º Cuatrimestre) Bases Celulares y Moleculares del Desarrollo -

2. Índice
• 1.Introducción.
▫ Definición
▫ Tipos
▫ Descubrimientos asociados
• 2.Genética de las células madre.
• 3.Patologías tratadas con células madre
• 4.Investigación
▫ Aislamiento y mantenimiento
▫ Inducción de la diferenciación
▫ Reprogramación celular
▫ Investigación básica
• 5.Aplicaciones clínicas
▫ Regeneración de tejidos por células madre adultas
▫ Crohn
▫ Insuficiencia cardiaca y reparación
• 6.Células madre y sociedad
▫ Principales polémicas
▫ Comités de Bioética
▫ Legislaciones
• 7.Conclusiones

3. Conceptos básicos
• Células totipotentes
• Células pluripotentes
• Células multipotentes
1. Introducción

4. Introducción
“Aquellas células con la capacidad para
dividirse simultáneamente; para mantener por
una parte su autorenovación y por otro lado
generar células hijas comprometidas en
distintos linajes celulares, que finalmente se
diferenciaran en células especializadas, no solo
morfológicamente, sino también
funcionalmente.”

5. Tipos de células madre

6. Células madre embrionarias

7. Células madre somáticas adultas

8. Hematopoyéticas

9. Mesenquimales

10. Otros tipos
• Células side
population
• Células
progenitoras
multipotencia
les adultas

11. Descubrimientos asociados
• http://www.preceden.com/timelines/55536-
history-of-stem-cells
¡¡ Atención Actividad !!
Poner en google:
Preceden stem cells timeline
Picar en el primer enlace.

12. Genes ES: Factores de Transcripción
Regulación Cis.
• Promotores colocados
corriente arriba.
-Caja CAATC: 50-130pb
delante, y C/EBP
proteína de unión.
-TATA: 20-30pb delante,
y proteínas TF IIA, B, C.
Regulación Trans
• Ayuda de proteínas
• No interacción ADN
polimerasas y ADN.
• Se unen al surco mayor.
• Transcripción basal y
histoespecífica
• ADN, ADN polimerasa y
factores generales

13. Shinya Yamanaka y Kazutozhi Takahashi
2. Genética de las Células Madre

14. Inducción de la pluripotencialidad
• Factores que mantienen
la identidad de célula
madre.
• ¿Podrían servir para
inducir la
pluripotencialidad en
células somáticas?
• 24 factores “candidatos”.

15. Diseño del ensayo
• Selección por resistencia a G418
• Construcción a insertar:
-B- galactosidasa
-resistencia a neomicina
• Factor candidato
• Target gen: Fbx15
• Trasnducción retroviral

16. Primeros resultados y conclusiones
• En ninguna de las inserciones de factores
individualmente se obtenían colonias.
• El tratamiento con los 24 factores conseguía:
-22 colonias
- Morfología similar a las de las células madre.
- Mismo tiempo de división de células madre.
- Marcadores de cel. Madre
- metilación diferencial de promotores.

17. Reducción de factores imprescindibles
• Retirada de factores uno a uno:
- 10 factores imprescindibles:
Mayor proporción de células madre.

18. Reducción de los factores
imprescindibles
• Retirada del pool de 10 factores:
- Oct 4 y Kfl4 retirada  No crecimiento
-Sox retirada Pocas colonias
- C-myc retirada se perdía la morfología de células madre
- La sustracción de los demás factores no afecta al nº de
colonias

19. ¿iES son idénticas a las células madre?
• RT-PCR, fosfatasa
alcalina y actividad
telomerasa:
Similares pero no
idénticas a las ES.
• MEF 3 es
sustancialmente
diferente de MEF 4 y
MEF10.

20. Pluripotencialidad in vivo
• Inyección subcutánea de iES
• Resultado formación de
teratomas
• MEF10 produce 5 tumores 2
(3 capas germinales)
• MEF4 produce 3 tumores
2(3 capas germinativas)
No todas las células
producen
pluripotencia.

21. Regulación de la pluripotencia
• OCT4 interactúa BMP4 y determina 4 destinos:
- (+)OCT4,(-)BMP4: autorrenovación
- (+)OCT4,(+)BMP4: mesodermo
-(-)OCT4, (+)BMP4: extraembrionarios
-(-)OCT4, (-)BMP4: Ectodermo
• Nanog reprime la diferenciación en ectodermo
• SOX3 y SOX 4 son redundantes e inhiben la formación
de mesodermo.
LOS FACTORES NO SON PANREPRESORES DE
LA DIFERENCIACIÓN CADA FACTOR
CONTROLA EL DESTINO ESPECÍFICO DE CADA
CÉLULA

23. C-myc
• Es un factor de trasncripción
• 15% genoma: enhancers box y histonas
acetiltransferasas.
• Hélice giro hélice/ cremallera de leucina.
• E box: Secuencia consenso CANNTG.
• Histonas aciltransferasas: acetilación de lisinas.

25. 3. Patologías tratadas con células madre
• Leucemia:
– Afecta a los glóbulos
blancos principalmente o
a precursores de los
mieloides .
– Transfusión de sangre
por goteo a través de un
catéter
– Suministro de
antibióticos y
alimentación a través de
un catéter.
– La leucemia desaparece a
los 2 años.

26. Patologías tratadas con células madre
• Síndromes
mielodisplásicos:
– También denominada
preleucemia.
– Perdida de la síntesis de
glóbulos rojos normales
– Quimioterapia y
radiación total destruir las
células de la medula ósea.
– Trasplante de células
madre de la medula ósea:
– Alotrasplante
– Autotrasplante

27. Patologías tratadas con células madre
• Parálisis cerebral:
– Daño en el cerebro durante el
embarazo, parto o después
del nacimiento
– Las células madre del
cordón umbilical:
• Estimula la angiogénesis
• Reparación de la materia
blanca y gris
• División en nuevas neuronas
• Fortalecimiento muscular
• Respuesta inmune
potenciada
– Mejorías en el 85% de los
pacientes tratados.

28. Patologías tratadas con células madre
• Retinopatía diabética:
▫ Perdida de visión provocada
por elevados niveles de
glucosa en sangre
▫ Bloque del riego sanguíneo
ocular
▫ Células madre por inyección
que regeneran los vasos
sanguíneos de la retina

29. Patologías tratadas con células madre
• Enfermedad de Crohn:
– Origen desconocido y base
genética que tiene un
componente autoinmune
– El sistema inmunitario del
individuo ataca su propio
intestino produciendo
inflamación
– El trasplante autólogo de
células madre :
• Primera quimioterapia
• Migración de células madre a
la sangre
• Aislamiento de las células
madre mediante aféresis
• Crioconservación de las
células madre
• Segunda quimioterapia
• Trasplante autólogo de células
madre:

30. 1. Aislamiento y mantenimiento de las células madre
• Determinación del
origen de la célula:
tejido embrionario
adultos o somáticos
• Eliminar células
‘contaminantes’:
▫ Unión de anticuerpos
específicos
▫ Destrucción con células
del complemento
▫ Adhesión de membrana
4. Investigación

31. Métodos de obtención de células
madre
• Embriones
crioconservados:
– Originados de la
reproducción asistida
– Nitrógeno liquido -196ºC
– Duran 5 años
– Problema al descongelar:
método de vitrificación
– 90% de supervivencia a la
descongelación

32. Métodos de obtención de células
madre
• Blastómeros individuales:
– Fecundación de óvulos
– 8 o 10 células
– Extracción de una célula y cultivo.
– Obtención de dos líneas celulares: pluripotencialidad y
cariotipo normal
– El embrión cultivado no es destruido

33. Métodos de obtención de células
madre
• Partenogénesis.
– Inducida por métodos
químicos y físicos in vitro
– No existe material genético
masculino.
– Desarrollo anormal:
improntas genéticas
– Uso solo en producción de
células madre y no en
reproducción.
– Masa de células:
partenote de la que se
obtienen las células madre

34. Métodos de obtención de células
madre
• Donantes cadavéricos:
▫ Congelación de células
musculares.
▫ Mantienen propiedades y
sobreviven.
▫ Tratamiento con fibrina
▫ Pueden convertirse en piel

35. Métodos de obtención de células
madre
• Clonación de embriones:
– A partir de una célula de la
piel
– Blastocisto de 70 a 100
células del que se obtienen las
células madre
– Carga de material genético
excesiva
– Uso en regeneración de
tejidos y prueba de
fármacos

36. Fase final del aislamiento de células
madre
• Se cultivan en un caldo de
cultivo
• Alcance de densidad celular
medida por cartometría de
flujo o inmunoanálisis
• Identificación cultivos puros
de células madre especificas

37. 4. Investigación.
2. Inducción a la Diferenciación

38. 2. Inducción a la Diferenciación
Protocolo de obtención de CTPA
Marcadores presentes en CTPA

39. 2. Inducción a la diferenciación.

40. 2. Inducción a la diferenciación
• CPTA hacia osteocitos.
Crecimiento en medio específico
Β-glicerofosfato
Ascorbato-fosfato
(durante 2 semanas recambio cada 2 días)
Aparición de Osteocalcina
(marcador de tejido óseo)

41. 2. Inducción a la diferenciación
• CPTA hacia hepatocitos
Transfección
FXO A1- A2
SOX17
GATA4
HFNa

42. 2. Inducción a la diferenciación
• CPTA hacia Isletas β.
Insulina
Transferrina
Selectina
Activina A
Β mercaptoetanol
Taurina
Pdx-1

43. 2. Inducción a la diferenciación
• CPTA hacia células Neuronales
Azacitidina
B27
Neuronal Growing Factors

44. 2. Inducción a la diferenciación
• CPTA hacia cardiomiocitos.
Cultivo en medio con factores
5-azacitidina
Tricostatina A
Aparición de Actina
Capacidad contráctil
Metabolismo Ca2+ asociado

45. 4. Investigación.
3. Reprogramación

46. 4. Investigación.
3. Investigación básica andaluza y actual

47. 4. Investigación
3. Investigación básica andaluza y actual
Líneas de Investigación del grupo del Dr
Peter Askjaer

48. 4. Investigación.
3. Investigación básica andaluza y actual.

49. 4. Investigación
3. Investigación básica andaluza y actual

50. 5. Aplicaciones clínicas
1. Regeneración de tejidos por células madre adultas

51. 2. Insuficiencia cardíaca y reparación
5. Aplicaciones clínicas

52. “La preocupación con la que la sociedad
esté viendo una aplicación científica
puede acabar necesitando el
posicionamiento de los poderes públicos y,
por tanto, acabar convirtiéndose en una
cuestión política”
Dr. Pere Puigdomènech
6. Células Madre y Sociedad

53. Preguntas para la reflexión…
• ¿A partir de cuándo un ser humano es un ser
humano?
• ¿Sería lícito crear embriones a partir de seres adultos
con fines terapéuticos?
• ¿Se deben considerar los criterios de la iglesia en estas
cuestiones?
• ¿Hay que restringir la investigación con células
embrionarias sólo a embriones sobrantes actualmente
almacenados?
6. Células Madre y Sociedad
1. Principales polémicas

59. 2.Comités de Bioética
• Comité normativo y/o consultivo
• Comité de ética de la investigación
• Comité asistencial/hospitalaria
• Comité de asociaciones de profesionales de la salud
6. Células Madre y Sociedad

60. 3.Legislaciones
• Ley 14/2006 del 26 de mayo
• Real Decreto 1301/2006, del 10 de noviembre
• Ley 14/2007, del 3 de julio
• Convenio de derechos humanos y biomedicina de
Oviedo, 1997
• Legislación de EEUU
6. Células Madre y Sociedad

61. 7. Conclusiones
• Las células madre están presentes en todas las fases del
crecimiento de un ser vivo.
• Diversos factores genéticos y su regulación marcan la
diferenciación de las células.
• En la actualidad muchas patologías son tratables con
células madre con resultados menos perniciosos para los
pacientes que los tratamientos más convencionales.
• La investigación con células madre es un campo muy
atractivo para la obtención de aplicaciones clínicas y
como investigación básica.
• El empleo y estudio de estas células es un tema de
candente actualidad con posiciones muy opuestas a nivel
social, político y religioso.

62. ¡¡ Muchas gracias por vuestra atención !!
ACTIVIDAD
• http://www.elalumnodebq.blogspot.com.es/