1. A polysaccharide fraction of adlay seed ( Coix
lachryma-jobi L.) induces apoptosis in human non-
small cell lung cancer A549 cells
Xiangyi Lu a, Wei Liu a, Junhua Wua, Mengxian Li a,
Juncheng Wangb, Jihui Wub, Cheng Luo
•DANIELA URREGO
•MATEO ZAPATA

3. INTRODUCTION
APOPTOSIS
Is a process in multicellular organisms, where
cells that are no longer needed or are a threat
to the organism are destroyed.

4. INTRODUCTION
Apoptosis is mediated by proteolytic enzymes
called caspases, which trigger cell death.

5. INTRODUCTION
CANCER
Is the uncontrolled growth of abnormal cells in
the body.
There are many different kinds of cancer but it
most are diagnosed by biopsy.

6. INTRODUCTION
Symptoms of cancer depend on the type and
location of the cancer.
The outlook and treatment varies based on the
type of cancer and its stage.

7. INTRODUCTION
LUNG CANCER
There are small cell lung cancer and non-small
cell lung cancer.
The most common types of NSCLC are
squamous cell carcinoma, large cell carcinoma,
and adenocarcinoma.

8. INTRODUCTION
Non-small cell lung cancer (NSCLC) are
associated with cigarette smoke, however
adenocarcinomas may be found in patients who
have never smoked.
NSCLCs are relatively insensitive to
chemotherapy and radiation therapy compared
with SCLC.

9. INTRODUCTION
EXTRATC
Is a concentrated form of something, whether
solid, viscid, or liquid, of a food, flavoring, etc.

10. INTRODUCTION
DIFFERENT SEED EXTRACTS FROM ADLAY SEED
HAVE BEEN USED FOR THE TREATMENT OF
VARIOUS CANCERS IN CHINA, AND CLINICAL
DATA SUPPORT THE USE OF THESE EXTRACTS
FOR CANCER THERAPY IN THIS CASE OF LUNG
CANCER.

12. OBJECTIVE
The objective of the study was to test the
induction of apoptosis by the CP1 to A549 cells

14. MATERIALES
RPMI 1640
RevertAid kit de la primera cadena de sintesis
de cdna fragmentada
Suero fetal bovino
 Solución de penicilina-estreptomicina
 Tripsina
Tampón fosfato salino (PBS)
Dimetil sulfoside (DMSO), 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-
il) -2,5-diphenyltertrazolium bromuro (MTT)
Agarosa de bajo y normal punto de fusión

15. MATERIALES
Propidio iodidewas
Anexina V FITC Kit de detección de apoptosis
RNeasy Mini Kit
anticuerpos contra b-actina
caspasa-3 y 9
Peroxidasa de rábano picante conjugado con
anticuerpos secundarios

16. MÉTODOS
PURIFICACIÓN DEL POLISACÁRIDO CP-1
El polisacárido CP-1 fue extraído a partir de
semillas adlay mediante técnicas de
hundimiento de etanol.
CULTIVO
Células humanas no pequeñas de cáncer de
pulmón de la línea celular A549 en RPMI 1640,
con suero fetal bovino y penicilina-
estreptomicina, a 37º C

17. MÉTODOS
VIABILIDAD CELULAR
El efecto de CP-1 sobre la viabilidad de las
células A549 se evaluó mediante el ensayo de
MTT.
OBSERVACIONES MORFOLÓGICAS
Los cambios morfológicos fueron observadas
bajo un microscopio electrónico de barrido
(SEM).

18. MÉTODOS
ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR
Se realizó por citometría de flujo, y la población
de células en cada fase se calculó utilizando el
programa de software de la Modifit LT. Cada
experimento se realizó tres veces.

19. MÉTODOS
CITOMETRÍA DE FLUJO
Detención del ciclo
celular en la fase S y la
inducción de la
apoptosis en las células
A549 por CP-1.
El haz de luz laser
cuando atraviesa una
célula sufre una
dispersión que puede
ser evidenciada en un
fotodetector.

20. MÉTODOS
COMETA
Cuantificar la fragmentación de ADN asociado con el
daño del ADN causado por la apoptosis.

21. MÉTODOS
WESTERN BLOT
Medir las cantidades relativas de la caspasa 3 y
la caspasa 9 en las muestra de cultivo.
 Las proteínas se separan por electroforesis en
gel, por lo general SDS-PAGE .
Las proteínas se transfirieron a un filtro, que se
incuba con una anticuerpo que se relaciona con
la proteína de interés.
El anticuerpo unido al filtro puede ser detectado
de varias formas, identificando por ende la
proteína de interés

22. RESULTADOS

23. RESULTADOS
CP-1 inhibió el crecimiento de las células A549 in
vitro
Esto lo hizo de una manera tiempo y
concentración dependiente (MTT)

24. RESULTADOS
Por observaciones morfológicas (SEM) se logró
determinar que el CP-1 induce apoptosis en las
células A549
Esto igualmente es dependiente de la
concentración

25. RESULTADOS

26. RESULTADOS
En la primer imagen(control) se observan micro
vellosidades densas con protuberancias menores
En 100 μg/ml se comienzan a observar micro
vellosidades delgadas, un poco mas grandes y
en mayor cantidad
A 200 μg/ml se formaron arrugas en la
superficie
A 300 μg/ml se formaron cuerpos apoptóticos en
la superficie celular

27. RESULTADOS
Efectos del CP-1 en la distribución del ciclo
celular de las células A549 (Citometría de flujo):
La fracción apoptótica aumentó a medida que se
aplico el CP-1
La reducción en la proliferación se asocia al
acumulo de células en la fase S del ciclo celular

28. RESULTADOS

29. RESULTADOS
B. Se observa el aumento en el pico sub G1 a
medida que se adicionó el CP-1. También se
evidenció el incremento en las células en fase S,
a expensas de la concentración de CP-1
Generalmente en G1 y G2 se disminuyó el
número de células con la adición del CP-1

30. RESULTADOS
CP-1 indujo apoptosis en A549(Tinción de
anexina)
La proporción de apoptosis aumentó en células
tratadas con CP-1 con respecto a células que no
recibieron el tratamiento.
CP-1 indujo apoptosis mediante el detenimiento
de la proliferación celular

32. C. Citometría de flujo +tinción con anexina
mostró el porcentaje de células apoptóticas a
medida que se añadió el CP-1
D. A medida que se añadió el CP-1, se aumentó
el % de células apoptóticas. Se inició con un 2%
a una concentración de 1 μg/ml, y se obtuvo un
porcentaje de 19% a una concentración de 4
μg/ml

33. Se analizó la expresión de las proteínas
caspasa-3 y caspasa-9 por western blot
La expresión de dichas proteínas aumentó
representativamente a concentraciones de 200 y
300 mg/dL de CP-1. Esto contribuye a la
apoptosis de la célula A549

35. E. El carril 1 muestra el control, el carril 2
muestra la expresión a una concentración de
200 mg/dL de CP-1 en la cual se observa una
mayor expresión que en el control, y en el carril
3 se observa la expresión a una concentración
de 300 mg/dL de CP-1 en la cual se evidenció el
gran cambio con respecto al control con una
mayor expresión de las caspasas 3 y 9

36. F. De manera gráfica se evidencia el aumento en
la expresión de las caspasas 3 y 9 a medida que
se aumenta la concentración del CP-1

37. Se midió el daño del DNA por el método de la
cometa
Se evidenció mayor tamaño de la cola a mayores
concentraciones de CP-1, evidencia de mayor
daño del DNA

39. A. Análisis de cometa por microscopía de barrido
laser confocal a 543nm
El largo de la cola aumenta progresivamente
proporcional al aumento de la concentracón de
CP-1
Se evidencia una cola mas larga a una
concentración mayor de CP-1 (300 μg/ml)
B. De manera gráfica se observa el aumento en
la longitud de la cola con un aumento en la
concentración de CP-1

40. Análisis del potencial de membrana mitocondrial:
A medida que se añadió el CP-1, se perdió el
potencial de membrana mitocondrial por la
despolarización de esta, esto es un paso inicial y
completamente irreversible de la apoptosis
celular. Es otro parámetro más que apoya la
tesis expuesta por los autores.

42. C. Se observa la disminución del potencial de
membrana mitocondrial a medida que aumenta
la concentración del CP-1
D. De manera gráfica se evidencia la diferencia
existente a medida que aumenta la CP-1, con
una disminución marcada del potencia como
gran determinante de la apoptosis celular
impulsada por el CP-1

44. REFERENCE What He,She or They said Agree/
Disagree
D.W. Fairbairn, P.L. Olive, “The movement of the DNA from the
K.L. O’Neill, The comet
assay: a comprehensive
review, Mutat. Res. 339
head to the tail has been
described as the most obvious
characteristic of apoptotic cells in
YES
(1995) 37–59. the comet assay”
S.W. Lowe, A.W. Lin, “The caspase gene family plays a central
Apoptosis in cancer,
Carcinogenesis 21 (2000)
485–495
role in mitochondriamediated
Apoptosis” YES

45. Reference What He,She or They said Agree/
Disagree
A.G. Yakovlev, S.M. “Caspase-3 contributes to the
Knoblach, L. Fan, et al.,
Activation of CPP32-like
caspases
execution
of apoptosis via the activation,
hydrolysis and proteolysis of
YES
contributes to neuronal specific substrates such as DNA-
apoptosis and neurological dependent protein kinases”
dysfunction after
traumatic brain injury, J.
Neurosci. 17 (1997) 74l5–
7424.

46. Reference What He,She or They said Agree/
Disagree
J. Wu, J. Zhou, Y. Lang, et “The disruption of mitochondrial
al., A polysaccharide from
Armillaria mellea exhibits
strong in vitro anticancer
membrane potential, which typically
leads to the activation of caspase-3 and
caspase-9, by CP-1,
YES
activity via apoptosis- further suggested that a mitochondria-
involved mechanisms, Int. dependent pathway was involved
J. in the induction of apoptosis by CP-1.”
Biol. Macromol. 4 (2012)
663–667.

48. CONCLUSIONS
1. The main conclusion is obtained after reviewing
this document is the induction of apoptosis in
A549 cells by the CP-1
2. In addition to this it could be concluded that the
induction of apoptosis by the CP1 is usually
concentration dependent

49. CONCLUSION
3. The loss of mitochondrial membrane potential is
a step also induced CP1 which quickly leads to
apoptosis
4. The expression of caspases 3 and 9 also
regulated by the CP1 is a very important
indicator when stop stimulate proliferation and
apoptosis of A549 cells

53. GRACIAS