2. MATERIALES Y METODOS

3. IN VITRO Las células del 5º pasaje PTHrP humano CSF-1 humano tiempo-dependientes del CSF-1 5min 15min 30min 1h 3h 12h 24h 48h

5. Aislamiento de RNA y transcripción reversa/ cadena- reacción de la polimerasa (RT- PCR)

6. RESULTADOS Caída: 3 días en ratas 5 días en ratones folículo dental de las ratas y ratones El gen del OPG se inhibe cuando las células son incubadas en PTHrP (1ng PTHrP) La inhibición en el tiempo se vio después de 30 min de incubación en PTHrP La incubación de las células foliculares con CSF-1 inhibe la expresión del gen OPG (1ng CSF-1) CSF-1 inhibe la expresión del OPG después de 12 h de incubación. MCP-1 e IL-1 α , no inhiben

7. DISCUSION inhibición de la expresión del gen del OPG 3 días en ratas 5 días en ratones máximo numero de osteoclastos alrededor del hueso alveolar del 1er molar mandibular Simonet et al 1997, Yasuda et al. 1998 – 1999: OPG inhibe la formación y activación del osteoclasto

11. El propósito de este estudio fue determinar la expresión de MyD88 in vivo, así como también su posible papel en la osteoclastogenesis y la erupción dental.

13. 2.- Aislamiento del ARN. Usando Tri-Reagent ( Molecular Research center, Cincinnati, OH, USA) El RNA fue tratado con Dnasa I a 37ºC por 1h para remover la contaminacion con DNA posible. El RNA total fue cuantificado a una absorbancia de 260nm usando un espectrofotometro y la pureza del RNA fue confirmada con un radio A260/A280 de 2.0 o mas alto

14. 3.- Microseleccion del DNA El RNA del folículo dental de ratas de 1-11 días fue etiquetado con biotina 16-UTP para generar RNA complementario, usando el Kit TrueLabeling-AMP 2.0. El cRNA fue hibridado a una quimioquina de rata y la Microseleccion del oligo DNA receptor que contiene 113 genes en una hibridación a 60ºC por 18h, seguido de 2 lavados a la misma temperatura. Después de la Hibridación el bloqueo del buffer de 40m fue incubada con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina por 10m y lavada 4 veces por 5m. La selección fue visualizada con incubación de sustrato quimio luminiscente CDP-Star a temperatura ambiente por 5m. La imagen fue adquirida a los 20m usando FluoChem 8800 Los datos se analizaron con software

15. 4.- Transcripción reversa en tiempo real-Reaccion en cadena de polimerasa Para la transcripción: Usaron 2miligramos de RNA total usando la transcriptasa inversa. Fue presentada a 37ºC por 1h seguido de una incubación de 10m a 70ºC para activar la Transcriptasa Inversa Para la Reacción en cadena: Fue usada para analizar la expresión del MyD88, NF-Kb-1, MCP-1, RANKL en las células DF.

16. 5.- Transfeccion in vitro de células DF con RNA de interferencia pequeño

17. 6.- Imnuno Tinción Se usaron las mandíbulas de las ratas en el 5to día postnatal, fijadas al 10% de formalina buffered neutral Descalcificadas, deshidratadas, hincadas en parafina y seccionadas a 5um de grosor.

18. 7.- Tratamiento con IL-1alfa.

21. 9.- Análisis estadístico Microseleccion de ADN, ensayos de Quimiotaxis y osteoclastogenesis in vitro Programa SAS El análisis de Varianza ANOVA Expresión del gen cronológicamente Prue ba LSD Los medios fueron separados Nivel P menor o igual a 0,05