1. Joana Azevedo e Victor Freitas
REQUIMTE/ Laboratório Associado Química Verde
Faculdade de Ciências da Universidade do Porto
vfreitas@fc.up.pt
joana.azevedo@fc.up.pt
25 Marzo 2015
MIGRACIÓN DE LOS
COMPUESTOS FENÓLICOS
DEL CORCHO AL VINO

2. Evidencias!
 Disoluciones de vino modelo
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Algunos meses
después
Color amarillo
pálido

3. Hipótesis
 ¿Hay una migración de los compuestos del corcho al vino?
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Esto es bueno o malo?

4. Hipótesis
 ¿Qué tipo de compuestos migran?
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Corcho
Constituyentes
estructurales
Suberina
Lignina
Polisacáridos
Constituyentes no
estructurales
Inorgánicos
Extractables
ceras
Pequeñas
moléculas
Compuestos
fenólicos

5. Compuestos FenólicosINTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Compuestos
Fenólicos
Color
(antocianons y
flavanoles)
Astringentes y
amargos
anticancerígenicos
antioxidantes
Taninos
Taninos hidrolizables
Ácido Galico Ácido Elágico
Taninos
Condensados

6. Caracterización de los compuestos fenólicos del corchoINTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMENT
OS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Fraccionamiento mediante cromatografía de baja presión
(Toyopearl ®, 250 x 25 mm d. i.,eluyente: MeOH; flujo: 0.8 mL.min-1)
Maceración hidroalcóholica del corcho
(12% EtOH; 5.0 gL-1 ácido tartarico; pH 3.2)
Purificación y aislamiento mediante HPLC-DAD semi-preparativa
Caracterización mediante HPLC-DAD/ESI-MS y RMN

7. INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
 Fraccionamiento del extracto de corcho (Toyopearl®)
Cromatograma :
Ácidos Fenólicos y Aldeidos (A, B, C y D)
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
COOH
OH
OH
C
H
CH COOH
OH
C
H
CH
MeO
COH
Gallic acid Protocatechuic acid
Conyferaldehyde
Cafeic Acid
OH
COH
MeO
Vanilin
Derivados Ácido Elagico y Gálico (F, G y H)
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
m/z 301
OH
OH
OH
OH
COOH
COOH
OH O
OH
OH
OHHOOC
m/z 505
O
OO
OOH
OH
OH
O
OH
OH
OHHOOC
m/z 469
Ellagic Acid Valoneic Acid Valoneic Acid Dilactone
FERNANDES, A., MATEUS, N., CABRAL, M., de FREITAS, V. Analysis of phenolic compounds
in cork from Quercus suber L. by HPLC-DAD/ESI-MS. Food Chemistry 125, 2011, 1398-1405.
Identificación por LC ESI/MS
Identificación de los compuestos del corcho

8. Identificación de los compuestos del corchoINTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Taninos elágicos (H, I, J, K, L y M)
Identification by LC ESI/MS
OH
OH
OH
O
OO
OH
O
OH
O
H
H
OHOH
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OO
O
O
OH
O
H
H
OHOH
OH
OOH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OHOH
OH
OOH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OO
O
O
OH
O
H
H
m/z 633
(HHDP-galoyl-glucose)
m/z 783
(diHHDP-glucose)
m/z 785
(HHDP-digaloyl-glucose)
OHOH
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OO
O
O
O
O
H
H
m/z 935
(diHHDP-galoyl-glucose)
OHOH
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OO
O
O
O
O
H
H
OH
OH
OH
O
m/z 937
(HHDP-trigaloyl-glucose)
O
HO OH
OHOHOHOH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O O
O
O
O
O
R1
OO
O
R2
m/z 933
(Castalagin/ vescalagin)
 Fracionamiento extracto del Corcho (Toyopearl®) –
Chromatogram :
FERNANDES, A., MATEUS, N., CABRAL, M., de FREITAS, V. Analysis of phenolic compounds
in cork from Quercus suber L. by HPLC-DAD/ESI-MS. Food Chemistry 125, 2011, 1398-1405.

9. Compuestos fenólicos identificados en corchoINTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Postulated Compounds Compound number [M-H]- m/z MS2 ions (m/z) MS3 ions (m/z)* l máx (nm) Fraction
Protocatechuic aldehyde 1 137 109 - 280; 310 I
Vanillin 2 151 136 108 279; 308 I
Protocatechuic acid 3 153 109 - 259; 293 I
Gallic acid 4 169 125 97 270 I
Conyferaldehyde 5 177 162 133; 120; 106 289; 340 I
Caffeic acid 6 179 - - 322 I
Ferulic acid 7 193 149 134 319 I
Ellagic acid 8 301 257; 229 - 250; 373 I, II
Ellagic acid-pentose 9 433 301 257; 229 253; 373 I
Ellagic acid-deoxyhexose 10 447 301 257; 229 253; 373 I
Ellagic acid-hexose 11 463 301 257; 229 253; 373 I
Valoneic acid dilactone 12 469 425 407; 301 253; 373 II
HHDP-glucose 13 481 301 257; 229 262; 379 I
Valoneic acid 14 505 313 - 253; 370 II
Dehydrated tergallic-C-
glucoside
15 613 593; 523; 493 465; 301; 299 253; 373 II
HHDP-galloyl-glucose 16 633 463; 301 257; 229; 185 262 III
Trigalloy-glucose 17 635 483; 465 421; 313; 169 277 II
Di-HHDP-glucose 18 783 481; 301 257; 229 271 III; IV
HHDP-digalloyl-glucose 19 785 633; 483; 301 257; 229 271 III; IV
Tetragalloyl-glucose 20 787 635; 617 573; 465; 403 274 III
Castalagin / Vescalagin 21 933 915; 631 613; 569 247 VII; VIII
Di-HHDP-galloyl-glucose 22 935 633; 873; 783 571; 329; 299 271 VI
Trigalloyl-HHDP-glucose 23 937 785; 767; 635; 465 301 277 VIII
Pentagalloyl-glucose 24 939 787; 769 617; 599; 447 279 V
Mongolicain A / B 25 1175 873; 855; 721; 677 829; 785; 767 267 VIII
FERNANDES, A., MATEUS, N., CABRAL, M., de FREITAS, V. Analysis of phenolic compounds
in cork from Quercus suber L. by HPLC-DAD/ESI-MS. Food Chemistry 125, 2011, 1398-1405.

10. Propiedades AntioxidantesINTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrilhidrazyl) como radical libre. Los compuestos analizados reaccionan
con DPPH e inducen la disminución de la absorbancia medida a 515 nm.
FRAP (Ferric Reducing Power Assay). Los compuesto analizados reaccionan con FRAP e inducen el
aumento de la absorbancia a 593 nm
DPPH. + AH DPPH-H + A.

11. Propiedades AntioxidantesINTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
 Todos los compuestos individuales (a 10 mM) mostraron un poder reductor y la capacidad
de estabilizar los radicales libres
FERNANDES, A., FERNANDES, I., CRUZ, L.,MATEUS, N., CABRAL, M., FREITAS, V. 2009 Antioxidant and Biological Properties of Bioactive
Phenolic compounds from Quercus suber L.. J. Agric. Food Chem. 57, 11154-11160.

12. Propiedades Biológicas – Efecto antiproliferativo (ensayo SRB)INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Lineas de céulas
cancerígenas
(1,5 x 105 cells/mL):
- MCF-7, Células
cancerígenas mamarias
- CaCo-2 and HT-29, Células
cancerígenas del colon
FERNANDES, A., FERNANDES, I., CRUZ, L.,MATEUS, N., CABRAL, M., FREITAS, V. 2009 Antioxidant and Biological Properties of Bioactive
Phenolic compounds from Quercus suber L.. J. Agric. Food Chem. 57, 11154-11160.
Parada de la
incubación:
TCA 50 % , 1 h at 4ºC
Tinción:
SRB (0.4 %, 1 % acetic acid)
Lectura Abs a 490 nm:
Triz buffer (10 mM, pH 8.15, 30’)
Células (proteina)
24 h, 37 ºC, 5 % CO2
Concentración de los polifenonles

13. INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
MCF-7
0,0 3,3 12,5 25,0 50,0 100,0
0
30
60
90
120 di-HHDP-gluc
HHDP-digaloíl-gluc
di-HHDP-galoíl-gluc
trigaloíl-HHDP-gluc
Pentagaloíl-gluc
Castalagina
Mongolicanina B
Concentração (mM)
%Controlo(Abs492nm)
MCF-7
di-HHDP-gluc
HHDP-digaloíl-gluc
di-HHDP-galoíl-gluc
trigaloíl-HHDP-gluc
Pentagaloíl-gluc
Castalagina
Mongolicanina B
Caco-2
0,0 6,3 12,5 25,0 50,0 100,0
30
60
90
120
Concentração (mM)
%Controlo(Abs492nm)
HT-29
0,0 6,3 12,5 25,0 50,0 100,0
30
60
90
120
Concentração (mM)
%Controlo(Abs492nm)
 Todos los compuestos individuales fueron capaces de inhibir la proliferación de las tres líneas de células
cancerígenas estudiadas a las dos concentraciones más altas
Propiedades Biológicas – Efecto Antiproliferativo (ensayo SRB)
FERNANDES, A., FERNANDES, I., CRUZ, L.,MATEUS, N., CABRAL, M., FREITAS, V. 2009 Antioxidant and Biological Properties of Bioactive
Phenolic compounds from Quercus suber L.. J. Agric. Food Chem. 57, 11154-11160.
MCF-7
0,0 3,3 12,5 25,0 50,0 100,0
0
30
60
90
120 di-HHDP-gluc
HHDP-digaloíl-gluc
di-HHDP-galoíl-gluc
trigaloíl-HHDP-gluc
Pentagaloíl-gluc
Castalagina
Mongolicanina B
Concentração (mM)
%Inibição(Abs492nm)

14. Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de vino
modelo
INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
 ¿Hay una migración de los compuestos del
corcho hacia el vino?
 ¿En qué cantidad?
 ¿Estas cantidades influyen en la calidad del
vino?

15. INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de vino
modelo
Disoluciones de vino modelo almacenadas durante 36 meses a 30º C
Diferentes tipos de corcho:
FT- Corcho Natural “flor” con superficie tratada
TT- Corcho Natural “Third” con superficie tratada
La migración de los compuestos fue seguida por
HPLC-DAD/ESI-MS

16. INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Resultados – Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de
vino modelo
AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. 2014 Migration of Phenolic Compounds
from different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance.. Eur Food Res Technol 239, 951-960.
 Perfil representativo de HPLC de los compuestos fenólicos que migran desde las
disoluciones de vino modelo después de 18 meses de almacenamiento.
 Después de 9 meses los compuestos presentes en mayor
cantidad eran: ácido gálico, ácido protocatéquico, aldeido
protocatéquico y vainillina.
 Entre 18 y 27 meses de almacenamiento, se detectaron
compuestos más complejos como taninos hidrolizables.

17. INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES  El contenido de estos compuestos no es suficiente para influir en la calidad sensorial del
vino. Sin embargo, pueden tener un papel importante en reacciones redox.
AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. 2014 Migration of Phenolic Compounds
from different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance.. Eur Food Res Technol 239, 951-960.
Resultados – Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de
vino modelo
27 months
G
allic
acid
Protocatechuic
acid
C
astalagin/vescalagin
Protocatechuic
A
ldehyde
D
ehydrated
tercgallic-c-glucose
Valoneic
A
cidFerulic
A
cidC
afeic
A
cid
D
i-H
H
D
P-G
alloylglucose
VanilinM
ongolicain
Valoneic
A
cid-dilactone
Ellagic
A
cid
H
exose
Sinapic
A
cid
Ellagic
A
cid
Pentose
Ellagic
A
cid-deoxyhexoseEllagic
A
cid
0.0
0.1
0.2
0.3
2
4
6
8
10
Natural Cork "Flor" w ith surface treatment
Natural Cork "Third" w ith surface treatment
*
GallicAcidEquivalents(mg/L)

18. INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Resultados – Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de
vino modelo
 La diferencia en la migración de compuestos a lo largo del tiempo puede reforzar su
importancia en el envejcimiento del vino
AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. 2014 Migration of Phenolic Compounds
from different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance.. Eur Food Res Technol 239, 951-960.
0 5 10 15 20 25 30
0
2
4
6
8
10
12
14
***
Natural Cork "Third" w ith surf
Natural Cork "Flor" w ith surfa
Months
Totalphenolicsconcentration(mg/l)
gallicacideq.

19. INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGARDECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Propiedades Antioxidantes – disoluciones vino modelo
 Todas las disoluciones de vino modelo mostraron cierta capacidad para captar radicales
libres (DPPH) y poder reductor (FRAP)
 Esta capacidad aumentó considerablemente con los niveles de compuestos fenólicos totales.
AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. Migration of Phenolic Compounds from
different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance. Eur Food Res Technol 239, 2014, 951-960.
DPPH
FT TT
0
2
4
6
8
10
9 months
18 months
27 months
mMTroloxEquivalents
FRAP
FT TT
0
2
4
6
8
10
9 months
18 months
27 months
**
mMTroloxEquivalents

20. INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Actividad antiproliferativa utilizando 2 líneas celulares de
cancerígenas: MKN-28 and MCF-7
AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. Migration of Phenolic Compounds from
different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance. Eur Food Res Technol 239, 2014, 951-960.
IC50
*
± SEM
27 months
MKN-28 MCF-7
TT 14.80 ± 0.43 14.44 ± 0.18
FT 14.49 ± 0.70 15.16 ± 0.37
 Las disoluciones de vino modelo fueron capaces de inhibir la proliferación de las
dos líneas de células de cancer evaluadas
Stop incuba on:
TCA 50 % , 1 h at 4ºC
Stain:
SRB (0.4 %, 1 % ace c acid)
Read Abs at 490 nm:
Triz buffer (10 mM, pH 8.15, 30’)
Cells (protein)
24 h, 37 ºC, 5 % CO2
Polyphenol
Concentra ons
IC50, compound concentration (in μM) causing an
inhibition by 50 % of cell growth.

21. INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Estudios de Transporte Transepitelial
30’ 60’ 120’
Apical 0’
Caco-2
cell line
HPLC-DAD
UV-Vis Spectra
MS
MS, MS2 e MS3
Disoluciones de
vino modelo
Apical 120’
Apical
Basolateral
12-well polycarbonate transwell, 0,4-µm, 21 days

22. INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIEMEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Estudios de Transporte Transepitelial
 El transporte de los compuestos totales a través de células Caco-2 aumentó 20-30%
indempendientemente del tiempo de almacenamiento.
(los tres principales compuestos detectados en la cara basolateral fueron el ácido galico acid, el ácido
protocatéquico y el aldeido protocatéquico. Otros compuestos se encontraron en forma de contenido traza)
 No se detectaron diferencias entre los corchos “Flor” y “Third”.
AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. Migration of Phenolic Compounds from
different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance. Eur Food Res Technol 239, 2014, 951-960.
Basolateral
30
60
120
30
60
120
0
20
40
60
80
100
120
FT
TT
Incubation Time (min)
Transportefficiency(%)
Apical
0
120
0
120
0
20
40
60
80
100
120
FT
TT
Incubation Time (min)
Transportefficiency(%)
Wine model
solution
Apical
Basolateral

23. INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Conclusiones
 La liberación de los compuestos del corcho al vino aumenta con el tiempo
 Todas las disoluciones modelo mostraron cierta capacidad para captar radicales
libres (DPPH) y poder reductor (FRAP).
 La baja complejidad de la matriz fenólica parece facilitar su absorción y
biaoactividad
 Hipótesis: Los tapones de corcho pueden reforzar las propiedades fisico-
químicas y biológicas del vino debido a la migración de los compuestos
fenólicos del corcho hacia el vino durante el período de almacenamiento.

24. INTRODUCCIÓN
COMPUESTOS
FENÓLICOS
DATOS
PRELIMINARES
MIGRACIÓN DE
COMPUESTOS
AGRADECIMIEN
TOS
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Agradecimientos
“ O Vinho é o melhor lugar para se encontrar com os
amigos”
Carlos Arruda