Un resumen de mi actividad científica relacionada con la bioinformática hasta 2007. Empezando por el estudio computarizado de las amilasas para llegar a la predicción de las proteínas mitocondriales, y luego pasar a comprobar el modelo en otros eucariotas unicelulares y mis primeros pinitos en genómica con SeqTrim y Full-Lengther y el incipiente GenUMA.

1. Bioinformática: desde las proteínas
mitocondriales a la genómica
M. Gonzalo Claros Díaz
Departamento de Biología Molecular y Bioquímica
Instituto Andaluz de Biotecnología
Universidad de Málaga

2. 80%
α-amilasas
Maltasas
Invertasas
Glucoamilasas
Todo empezó con una amilasa...
AMY1-3
SWA2
ALP1
SWA1
DtAMYB
BmAMY
BcAMY
BlCGT
BmCGT
KpCGT
DtAMYC
PPAPPA
WhAMY
Unión de sustrato
Unión de Calcio
EWW RYQ
AYHGYW
AYHGYW
AYHGYW
AYHGYW
GYHGYW
SYHKYD
YHGYW
SYHGYW
R3
SYHGYD
SYHGYD
A
AYHGYW
SPEGYL
V
LMVDDVTNH
LMVDIVTNH
LMVDIVTNH
LMVDV ANH
IIIDFAPNH
Q HPLRP
R5
IYVDAVINH
LMVDYAPNH
VIMDLVVNH
VVIDFAPNH
IILD PNHVF
IILDLVVNH
CVADIVINH
IK
R
Q
FRLDAA M
IRFDAVK Y
IRVDAVKHM
IRVDAVKHM
L IDSAKHV
LRIDSAKHV
LRIDSAKHV
LRIDTVKHV
R7b
FRLDASKHM
WRLDFAKGY
FRLDAALHI
IRIDAIKHM
YRM DHA
FFFFGEWFGA
TFYFGEIVET
VYNLGEVYQG
VYSVGEVFQG
VYLLGEVYDG
VFTFGEWFLG
VFTFGEWFLG
R8
PFIFQEVIDL
AFVVGELYDR
VFTFGEWYLG
VYCIGEVLDG
VYLTGEVWD
VYLVGEVWDN
FIDNHDMDRF
FIDNHDMDRF
FVENHDNPRF
FIENHDQVRF
FVDNHDNQRG
TFIDNHDTGS
R9
FIENHDQPRL
FVENHDNERF
FMDNHDMARI
FLTNHDQNRV
FLDNHDMDRF
FLENHDSNRF
FLRNHDQVRV
Residuos catalíticos
5 motivos son importantes para la función

3. … que además conserva la estructura secundaria
PPA (cristal)
PPA
AMY1-3
SWA2
ALP1
AMY1
Aß5 Aα5 Aß6 Aα6 Aß7 Aα7 Aß8 Aα8Aα6' Cß1 Cß2 Cß3 Cß4 Cß5 Cß6 Cß7 Cß8
R8 R9 R10
PPA (cristal)
PPA
AMY1-3
SWA2
ALP1
AMY1
Aß1 Aα1 Aß2 Aα2 Aß3 Aα3 Aß4 Aα4Bß1 Bß2 Bß3 Bß4 Bß5 Bß6 Bß7
Bß1 Bß2 Bß3
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7
hélice α
hoja ß
Claros et al (1993) Curr. Genet. 24: 75-83

4. Predicción bioinformática completa de las α-amilasas
DOMINIO C
(ß antiparalelas)
DOMINIO B
(ß paralelas)
DOMINIO A
catalítico
(barril a/ß)
PEPTIDO
SEÑAL
DOMINIO C
DOMINIO B
DOMINIO A
Claros et al (1993) Curr. Genet. 24: 75-83

5. ¿Por qué tienen genoma las mitocondrias?
Núcleo
Mitocondria
Cytb
Cox1
ATP*
COX* Relocalización de los
genes mitocondriales en
el núcleo
Importación de las proteínas
mitocondriales codificadas
en el núcleo

6. Contenido génico de las mitocondrias de las algas
Funes et al (2002) Recent research
developments in human mitochondrial
myopathies. Research SignPost

7. Vías de importación de proteínas mitocondriales
Mitocondrias
de los animales
Mitocondrias de
los vegetales
Lister et al (2005) Mol Membr Biol 22(1-2): 87-100

8. Hipótesis para el mantenimiento del genoma
Las proteínas muy hidrófobas no se pueden importar
 Objetivos:
 Desarrollar un método in vivo para estudiar la importación
 Establecer las limitaciones del sistema de importación

9. La proteína quimérica
Presecuencia mitocondrial: Fo9
• Dirige correctamente una proteína a la mitocondria de levaduras
• Es capaz de translocar una proteína con dos dominios muy hidrófobos
• Duplicada es aún más eficiente
Proteína delatora: madurasa bI4
• Codificada por el intrón 4 del citocromo b
• Controla el ayuste de los intrones 5 de cytb y cox1
• Es muy sensible in vivo
• Hay una batería de mutantes disponible
• Fácil de rastrear por fenotipo
Citocromo b (cytb)
• En el genoma mitocondrial de todos los organismos estudiados
• Muy hidrófoba
• Inconveniente
— Código genético diferente
— No hay consenso sobre el número de dominios transmembranarios

10. El sistema experimental in vivo
Núcleo
mRNA
Mitocondria
mRNA (gly+)
pre-mRNA (gly-)
Gen quimérico
Proteína quimérica
Péptido de
tránsito
Proteína
delatora
Fragmentos
citocromo b
Claros et al (1996) Methods Enzymol 264: 389

11. ¿Cuántos dominios transmembranarios tiene el cyt b?
6004002000
-4
-2
0
2
100 300 500 700
<H>17(kcal/residue)
Aminoácidos
1 2 3 4 5 6 7 8
S 12345678 M
ATG
NcoI BglII

12. Algoritmo de dominios transmembranarios
 Para el citocromo b no valen los algorimos al uso
 No era posible predecir la topología
 Colaboración con Dr. Gunnar von Heijne (Universidad de Estocolmo)
para mejorar TopPred
• Ponderación piramidal de los dominios transmembranarios
— El centro del dominio es más importante que los bordes
• La composición de las regiones intermembranarias define la topología
 TopPred II
• Adaptado a eucariotas y procariotas
• Interfaz gráfico para interpretar la topología
— Más escalas de hidrofobia
— Personalización de los parámetros
— Representación gráfica de las topologías, los perfiles de hidrofobia, etc.
• Topologías ordenadas por probabilidad
• 98% acierto en procariotas
• 83% acierto en eucariotas.
Claros y von Heijne (1994) Comput Applic Biosci 10(6): 685-686

13. Estructura transmembranaria del cytb
1 2 3 4 5 6 7 8
Dominios transmembranarios Topología
N
C
∆Ψ +
∆Ψ-
1 2 3 4 5 6 7 8
Claros et al (1995) Eur J Biochem 241: 779-786

14. Uso de TopPred II
 Versión para OS Classic
 Ejecutable en la web:
• http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/toppred.html
 Paquete Biok (Inst. Pasteur)

15. Competidores actuales de TopPred II
Sadovskaya et al (2006) J.
Bioinf. Comp. Biol. 4(5):
1033-1056

16. TopPred II sigue siendo suficientemente fiable
Sadovskaya et al (2006) J. Bioinf. Comp. Biol. 4(5): 1033-1056
TopPred II está en el centro de la tabla, y no muy alejado de los algoritmos
basados en redes neuronales y HMM

17. Las proteínas recombinantes pueden complementar
los mutantes de respiración
M
SM
0M
S0M
1M
S1M
M
SM
0M S0M
1M S1M
MM -Leu (Glucosa) YEPG (Glicerol)
CON presecuenciaSIN presecuencia CON presecuenciaSIN presecuencia

18. Presencia de las proteínas quiméricas en la mitocondria
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
S1tag S56tag Control
Triton X-100
Pronase
S56tag
S1tag
56tag
1tag
ABF2 (HM)
28.5 kDa
17.4 kDa
15.3 kDa
Claros et al. (1995) Eur. J. Biochem. 228: 762-771

19. Importación de los fragmentos del citocromo b
M
SM
0M
S0M
1M
S1M
S12M
S123M
S1234M
S12345M
S56M
S8M
S78M
S678M
S12345678M
4.5 ± 0.3
17.5 ± 4.5
43.0 ± 3.6
∞
34.3 ± 2.5
5.1 ± 0.1
12.4 ± 0.5
∞
∞
Proteína recomb.
- ± ±
+ + +
+ + +
+ + +
- - -
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
- - -
+ + +
4.4 ± 0.5
3.5 ± 0.2
3.6 ± 0.1
3.6 ± 0.1
∞
4.4 ± 0.2
Respiración (crecimiento en glicerol)
CW05 CW02
Tiempo gener (h)18 30 37 18 30 37
Temperatura (°C)
- + +
- - -
- - -
- - -
- - -
- ± ±
- ± -
- - -
- - -
+ + +
+ + ±
± + -
- - -
± + -
+ + +
+ + ±
- - -
- - -
Claros et al. (1995) Eur. J. Biochem. 228: 762-771

20. MitoProt 1.0: predicción empírica de las proteínas
mitocondriales
Variables caculadas a sobre la secuencia de tránsito mitocondrial
• CoefTot , Coef20: composición de aminoácidos
• ZoneTo: Número máximo de residuos N-terminales para presecuencia
• CleavSite:
Sitio de corte de la peptidasa señal mitocondrial.
• KR: Número de residuos básicos
• DE: Número de residuos ácidos
• µH∂: medida de la anfipatía y la estructura en hélice α
• Hmax∂: medida del lado más hidrófobo de una hélice α
Variables calculadas sobre la secuencia completa
• ChDiff: Carga total. ChDiff > 0
• H17: Segmento más hidrófobo de 17 aa de longitud.
• MesoH: Mesohidrofobia (proximidad de los dominios transmembranarios)
 Uso de diferentes escalas de hidrofobia para los aminoácidos
Claros (1995) Comput Applic Biosci 11: 441-447

21. Análisis manual con MitoProt 1.0
0 10 20 30 40 50
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Amino Acid Position
∂ = 95°
∂ = 75°
µH
A
x
x
E
G
HI
Jx
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Maximal Hydrophobiciy
A -> ∂ = 65°
B -> ∂ = 70°
C -> ∂ = 75°
D -> ∂ = 80°
E -> ∂ = 85°
F -> ∂ = 90°
G -> ∂ = 95°
H -> ∂ = 100°
I -> ∂ = 105°
J -> ∂ = 110°
K -> ∂ = 115°
90% 95%
%Arg (13.5) = 10.0 OK OK
%Ala (14.1) = 4.0 BAD BAD
%Ser (11.2) = 4.0 BAD BAD
%Leu (12.2) = 8.0 OK OK
90% 95%
%Arg (13.5) = 9.5 OK OK
%Ala (14.1) = 9.5 OK OK
%Ser (11.2) = 4.8 OK OK
%Leu (12.2) = 9.5 OK OK
-2 -1 0 1 2
0
1
2
3
H17
Mesohydrophobicity
C
For residues from 1 to 50
For residues from 1 to 21
A
B
Claros (1995) Comput Applic Biosci 11: 441-447

22. La hidrofobia local y la mesohidrofobia limitan la
importación de las proteínas mitocondriales
11
11
Mesohidrofobia (kJ)
210-1-2
5
7
9
5
7
9
S123M
S1-4M
S78M
S56M S1-8M
Fo
8
COX1
CYTbFo
9
COX10
Fo9 N.crassa
840-4-8
Br
NN
T
R+
R±
R–
SN
MN
MM
ATM1
Hidrofobialocal(KJ/residuo)
S1-5M
S678M
Proteínas
mitocondriales de
las levaduras
Construcciones
quiméricas
Claros et al. (1995) Eur. J. Biochem. 228: 762-771

23. MitoProt II: algoritmo predictor para las proteínas
mitocondriales
Secuencias: base de datos SWISS-PROT
Clasificación:
• Destino mitocondrial y no-mitocondrial
• Destino mitocondrial/cloroplastídico frente al resto
• Presencia de secuencia de tránsito mitocondrial
• Entrenamiento: 13 039
• Test: 1 664
Método: análisis discriminante
• Computar una función discriminante lineal ƒg(O)
— O: un secuencia;
— g: proteína mitocondrial
• 47 variables
P(O/g) = e
−0.5 fg (O)
e−0.5 fi (O)
i
∑
Claros y Vincens (1996) Eur J Biochem 241: 779-786

24. Predicción
SwissProt versión 31 SwissProt actualiz.
NO Mitocondrial
MITOCONDRIAL
Grupo
mitocondrial
19.60% (119)
80.40% (488)
Otras
localizaciones
88.67% (11023)
11.33% (1409)
24.53% (13)
75.47% (40)
88.90% (1405)
11.10% (206)
Fiabilidad de MitoProt II
13.039 secuencias 1.664 secuencias
Entrenamiento Verificación
Discriminación entre mitocondrial y no-mitocondrial
Grupo
mitocondrial
Otras
localizaciones
Claros y Vincens (1996) Eur J Biochem 241: 779-786

25. Fiabilidad de MitoProt II
Predicción de proteínas organulares
(cloroplasto y mitocondria) Predicción de proteínas mitocondriales
Claros y Vincens (1996) Eur J Biochem 241: 779-786

26. Fiabilidad de MitoProt II
Predicción
Grupo mitocondrial Grupo NO mitocondrial
Entrenamiento Verificación
Incluye
proteínas
cloroplast.
Excluye
proteínas
cloroplast.
NO Mitocondrial 8.77% (7) 5.31% (2) 76.28% (101) 84.25% (87)
Mitocondrial 91.23% 94.69% 23.72% 15.75%
Posible 38.61% (31) 45.92% (18) 16.48% (21) 11.15% (11)
Segura 52.62% (42) 48.77% (19) 7.24% (9) 4.60% (5)
Localiza las secuencias de tránsito mitocondrial
Claros y Vincens (1996) Eur J Biochem 241: 779-786

27. Características para que las proteínas se puedan
importar en la mitocondria
Que la proteína no sea muy hidrófoba
• No debe tener los dominios hidrófobos muy cercanos
• No debe tener una hidrofobia local muy alta
Que presente la secuencia de tránsito N-terminal
• Anfipática
• Hélice α
Composición de aminoácidos
• de la presecuencia N-terminal
— Rica en Arg y Lys
— Ausencia de Asp y Glu
• de la proteína completa
— pI alto: carga total positiva

28. Aislamiento de genes que supriman el límite hidrófobo
100.000 transf
(10X)Electroporación
Genoteca multicopia
YNG
YEPG
Replicación
S678M
gly-
S678M
gly+
Sup

29. El límite hidrófobo se puede suprimir
S678M
CDC36
S678M
SSN6
S678M
CDC36
S0M
Glicerol - + - - -+ + +Pronasa
S56tag
S56tag
CDC36
S56tag
SSN6CDC36
Abf2p
56tag
S56tag
Corral-Debrinski et al (1999) Mol. Microbiol. 31: 1499-1511

30. PSE1 aumenta la importación de proteínas
hidrófobas
Glucosa Glicerol
PSE1
PSE1-t
PSE1
PSE1-t
0,4 0,2 0,4 0,4 0,2 0,4 0,4 0,2 0,4
+ - - + - - + - +
Cox2p
Abf2p
S56tag
56tag
PK (µg/ml)
Trit. X-100
22 kDa
14 kDa
28 kDa
20 kDa
Pse1-t Pse1Control
0,5
1
1,5
2
2,5
Pse1
Pse1-t
Control
56tag 56tag Abf2pAbf2p
-PK +PK
Proteína/Cox2p
56 M
S 56
M
Corral-Debrinski et al (1999) Mol. Microbiol. 31: 1499-1511

31. Modelo para la importación de las proteínas hidrófobas
S
MPP
S
PK
S
S
Pse1p
PK
Ribosoma
Corral-Debrinski et al (1999) Mol. Microbiol. 31: 1499-1511
IM
OM
tag
Situación normal
Citoplasma
Matriz
mitocondrial
TOM
TIM
+ Proteasa
TOM
TIM TIM
TOM
S
+ Pse1p + Proteasa
¿Terapia génica?

32. El modelo se valida con los cox3 de algas
0
1
2
3
-2 -1 0 1 2
A
BC
DE F
G
H
I
J
KL
MNOR
Escala: GES
Mesohidrofobia
PQ
Hidrofobialocal
A ¬ Aegilops
B ¬ Candida
C ¬ Chrondrus
D ¬ Heliantus
E ¬ Magnolia
F ¬ Zea mays
G ¬ Oenothera
H ¬ Pilayella
I ¬ Prototheca
J ¬ Gracilariopsis
K ¬ Oriza sativa
L ¬ Schizosaccharomyces
M ¬ Glicyne
N ¬ Vicia faba
O ¬ Triticum
¬ Chlamydomonas
¬ Polytomella
R ¬ Homo sapiens
P
Q
Ps-Cox3
Cr-Cox3
MTSL
1-21
1-18
32-54
32-54
Preseq 2ª señal
P(DFM)
0,7
0,68
Chlamydomonas y Polytomella son las únicas algas con un cox3 (7 TM) nuclear
Pérez-Martínez et al (2000) J Biol Chem 275(39): 30144-30152

33. Dominios transmembranarios de Cox3p
Amino Acid Position
TopPred II
0 100 200
Bovine
Paracoccus
I II III IV V VI VII
-2
-1
0
1
2
Polytomella
-2
-1
0
1
2
3
Chlamydomonas
-2
-1
0
1
2
-2
-1
0
1
2
Pérez-Martínez et al (2000) J Biol Chem 275(39): 30144-30152
Funes et al (2002) Recent research developments in human
mitochondrial myopathies. Research SignPost, Mexico
<H17> media de las cox3 nucleares
<H17> media de las cox3 mitocondriales

34. Cox2p migrado de las algas respalda el modelo
Pérez-Martínez et al (2001) J. Biol. Chem. 276(14): 11302-11309
Funes et al (2002) Recent research developments in human
mitochondrial myopathies. Research SignPost, Mexico

35. Cox2p «en migración» también respalda el modelo
en las plantas
Mitocondrial
Nuclear
Daley et al (2002) Proc Natl. Acad Sci USA 99(16): 10510-10515

36. ATP6: topología (TopPred) e importabilidad (MitoProt)
Funes et al (2002) J. Biol. Chem. 277(8): 6051-6058
<H17> media de las cox3 mitocondriales
<H17> media de las cox3 nucleares

37. Cytf y subunidad IV verifican el modelo en cloroplastos
Santillán-Torres et al (2003) Biochim. Biophys. Acta 1064: 180-189
Cytƒ, sub IV y cyt b6 forman juntos el complejo cyt bf
• Cyt b6 es homólogo al N-terminal del cyt b mitocondrial
• Sub IV es homólogo al C-terminal del cyt b mitocondrial
• Los tres genes se suelen localizar en el cloroplasto
En Euglena, cyt f y sub IV están codificadas en el núcleo
• Han adquirido una secuencia de tránsito triple para localizarse en el
cloroplasto
— Primero un péptido señal para los microsomas (3ª membrana)
— Segundo una secuencia de tránsito cloroplastídica
— Tercero una señal de localización tilacoidal

38. En el cloroplasto hay más proteínas importables
Todavía hay muchas proteínas poco hidrófobas que se podrían
codificar en el núcleo
Santillán-Torres et al (2003) Biochim. Biophys. Acta 1064: 180-189

39. MitoProt II frente a otros algorimos similares
Jiang et al (2005) Mol.
Cell Proteom. 4(1): 12-34
Con datos
experimentales
Gabaldón (2006) Am J Physiol Cell Physiol
291: C1121-C1128
Con datos reales

40. Ejecución de MitoProt II
Programa para OS Classic y unix
Página web (MitoP2)
• http://mips.gsf.de/cgi-bin/proj/medgen/mitofilter
• http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html
Prokish et al (2006) Nucl. Acids
Res. 34: D705-711

41. Transporte de glutamina en el ciclo GS/GOGAT en pino
GLN
2-OG
GLU
CLOROPLASTOCITOSOL
NH
4
+ GLU
ATP
GS 1
GLN
Fdre
d
GOGAT
Fdox
GLU
ADP
GLU
2-OG
Mal Mal

42. Transporte de glutamina en el ciclo GS/GOGAT en pino
GLN
2-OG
GLU
CLOROPLASTOCITOSOL
NH
4
+ GLU
ATP
GS 1
GLN
Fdre
d
GOGAT
Fdox
GLU
ADP
GLU
2-OG
Mal Mal

43. Ensayo de importación de glutamina
Percoll 7% + [3
H]Gln
Cloroplastos enteros
Precargar con metabolito frío
[3
H]Gln
Lavado
Centrifugar y contar cpm en la fase inferior

44. Características del translocador Gln/Glu
0
25
50
75
100
Gln Glu Mal 2-OG Asp
Gln tomada
Glu exportado
Metabolito
µmol/h·mgChl
0 20 30
200
Km
300
TomadeGln(µmol·mg-1
·h-1
)
[Glutamina]
(mM)
10
0
10
GLN
GLU
GLN
GLU

45. LinesKinetics: un programa para facilitar los
cálculos cinéticos
Claros y Cánovas (1998) Embnet.news 5.1

46. Herramientas bioinformáticas para la genómica
Genuma: un portal con herramientas bioinformáticas
• Almacenamiento de secuencias
• Limpieza de secuencias
• Anotación
• Ensamblaje
Instituto Nacional de Bioinformática
PreP: normalización y expresión diferencial

47. Portal GenUMA

48. Estrategia de GenUMA

49. SeqTrim
Falgueras et al (2007) Enviado a
publicar
http://
castanea.ac.uma.es/
genuma/seqtrim

50. Cómo funciona SeqTrim
Falgueras et al (2007) Enviado a publicar

51. Interfaz de SeqTrim

52. Ventajas de SeqTrim
Listo para analizar con alto rendimiento
Fácil de instalar
• Necesita BLAST, phred y librerías de BioPERL
Interfaz simple
• Uso de colores orientativos
Compatible
• Admite varios formatos de entrada y salida
• Se puede encadenar con otros programas de análisis
Versátil
• Configuración de parámetros personalizable
• Secuencias contaminantes personalizables
Colaboración entre biólogos e informáticos

53. Full-Lengther
Aparicio et al (2007) Enviado a publicar
http://castanea.ac.uma.es/genuma/full-lengther

54. Cómo funciona Full-Lengther
BLAST con hits BLAST sin hits
Aparicio et al (2007) Enviado a publicar

55. Analizar una(s) secuencia(s)

56. Análisis en detalle de cada secuencia
Aparicio et al (2007) Enviado a publicar

57. Nodo GNV5 «Bioinformática Integrada» del INB

58. Portal del INB: MOWServ
http://www.inab.org/MOWServ
Claros et al (2007) En preparaciónNavas-Delgado (2005) Bioinformatics 22: 106-111

59. Contenido del MOWServ
Objeto de entrada
Servicio ejecutado
Objeto de salida

60. Búsqueda rápida de servicios
Claros et al (2007) En preparación

61. Ejecución de los servicios
Interfaz uniforme
Se guardan las ejecuciones
Se puede seguir la evolución de la ejecución
Existen flujos de tareas
• También se pueden definir otros nuevos
Navas-Delgado (2005) Bioinformatics 22: 106-111

62. Los flujos de tareas («workflows»)

63. Participantes
École Normale Supérieure (París, Francia)
Pierre Vincens
Javier Perea
Marisol Corral-Debrinski
Claude Jacq
Universidad de Estocolmo (Suecia)
Gunnar von Heijne
Laboratorio de Biología Molecular y
Biotecnología de Árboles
David Pacheco Villalobos
Sara Díaz Moreno
Antonio J. Lara Aparicio
Rocío Bautista Moreno
Marisa Aguilar Muñoz
Francisco R. Cantón
Francisco M. Cánovas
Dpto Arquitectura de Computadores
Guillermo Pérez Trabado
Oswaldo Trelles Salazar
Victoria Martín Requena
Dpto Lenguajes y Ciencias de la Computación
Juan Falgueras Cano
José Aldana Montes
Ismael Navas-Delgado
M.ª Mar Rojano
Universidad de Málaga