Clase N°4 - Purificación y secuenciación de acidos nucleicos Benoit Diringer final (6).pdf
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Clase N°4 - Purificación y secuenciación de acidos nucleicos Benoit Diringer final (6).pdf
- 1. Tema II: Tecnologías de Manipulación de Ácidos nucleicos Técnicas de purificación, amplificación y secuenciación de ácidos nucleicos Benoit DIRINGER Ph.D. 19-07-2023
- 2. • Francés, nacido en Le Port, Isla de la Reunión. • Estudios en Francia (Sete y Cherbourg) en ingeniera Acuícola y biología marina • Maestria en EPHE, (Montpelier) entre Francia y Brazil • Ph.D. EN PSL (Paris) entre Francia y Perú Benoit DIRINGER • Trabajo en especies diversos organismos y microorganismos nativos: Concha negra, pulpo, mano de léon, microalgas, algarrobo, SARS Cov2 y otros virus, caña de azúcar… • Actualmente Gerente de IncaBiotec SAC, • Profesor de la maestria de biotecnología molecular de la UNTumbes • Trabajado como asesor/consultor en Vietnam, Brazil Ecuador, Thailandia, España, Madagascar, • Coordinador, proyectista, investigador en diversos proyectos de I+D+i.
- 3. # Nombres y appellidos 1 Aponte Elera Demetrio Javier 2 Blas Rodríguez Evely Nerytha 3 Correa Saldarriaga Mario Ernesto 4 Cusiyunca Phoco Edilson Ronny 5 Dioses Imán David Steven 6 Flores Quintana Gonzalo Franco 7 Garces Paucar Katherine Liset 8 Granda Fernández Luis Guillermo 9 Guevara Gamarra Daniel Alonso 10 Mendoza Martínez Yuliana Danitza 11 Meza Ojeda Albertino 12 Noceda Rodríguez Manuel Fernando 13 Ocaña Huamàn Sabina Eleanor 14 Olivera Montenegro Luis 15 Pariona Velarde Carlos Daniel 16 Peña Vela Cindy Marissa 17 Peña Zárate Merli Clarita 18 Ramirez Díaz Yaritza Lisbeth 19 Reyes Valdiviezo Miguel Eduardo 20 Saavedra Gutierrez Jhoaam Alexis 21 Sánchez Zárate Christopher Douglas 22 Talledo Ancajima Delia Estefani 23 Torres Galarza Stephany Pamela 24 Vera Bonilla Jorge Jerson 25 Vilela Zeta Joselyn Yanira Preséntense !!! • Nombre • Lugar • Institución • Interés en el curso
- 4. Repaso de conceptos Breve historia de la secuenciación Secuenciación de Acidos nucleicos Diferentes plataformas Desarrollo de la clase
- 5. 1. Repaso de conceptos
- 8. EXTRACCIÓN DE ADN O ARN
- 11. Del gen a la proteína Todas estas moléculas contienen secuencias !!!
- 12. Este proceso permite la obtención de millones de copias de una secuencia específica del ADN analizado. 1) Desnaturalización 2) Hibridación 3) Polimerización PCR Reacción en cadena de polimerización Introducción a las biotecnologías moleculares
- 14. Grande Cadenas largas (desplazamiento lento) Pequeño Cadenas cortas (desplazamiento rápido) Clasificación de los fragmentos de ADN por tamaño Electroforesis
- 15. SECUENCIACIÓN
- 16. En genética y bioquímica, la secuenciación significa determinar la estructura primaria (a veces incorrectamente denominada secuencia primaria) de un biopolímero no ramificado. La secuenciación da como resultado una representación lineal simbólica conocida como secuencia que resume sucintamente gran parte de la estructura a nivel atómico de la molécula secuenciada. ADN-ARN-Proteinas Definición de secuenciación:
- 18. La secuenciación del ADN consiste en la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G, y T) en un fragmento del ADN. 18 Historia de la secuenciación
- 19. Secuenciación de genomas completos 1er genoma secuenciado por completo: 1995: Fleischmann et al. Haemophilus influenzae Bacteria Gram (-), Pasteurellaceae 24,304 fragmentos de ADN de 15.000 a 20.000 pb. 1 año 1.830.137 pb. Representación del cromosoma de Haemophilus influenzae Genomas secuenciados: > 1241 genomas bacterianos (ej.: Escherichia coli [4,6 Mpb]) > 2270 genomas virales (ej.: WSSV, [300 Kpb]) > Genomas de invertebrados (ej.: Anopheles gambiae, Caenorhabditis elegans, [97 Mpb], Drosophila melanogaster [116 Mpb], etc.) > Genomas de organismos superiores (ej.: Humano , Arabidopsis thaliana [120 Mpb], , arroz [420 Mpb], , chimpancé [3,1 Gpb], , ratón [2,8 Gpb], etc.)… Analizador de secuencias genómicas 1999: 1er cromosoma humano secuenciado 2000: Genoma completo de Drosophila melanogaster 2003: Secuencia completa del genoma humano [3,2 Gpb, 25.000 a 40.000 genes].
- 20. https://https.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ Una «explosión» de información 20
- 21. Cinética de evolución de la secuenciación genómica https://www.ibiology.org/techniques/next-generation-sequencing/
- 22. 3. Secuenciación de acidos nucleicos
- 23. Componentes de una célula bacteriana
- 24. Las dos cadenas del ADN forman una doble hélice • La doble hélice describe la apariencia del ADN de doble hebra, que se compone de dos hebras lineales que corren opuestas entre sí, o antiparalelas, y se retuercen juntas. • Cada hebra de ADN dentro de la doble hélice es una molécula lineal larga hecha de unidades más pequeñas llamadas nucleótidos que forman una cadena.
- 25. ADN - ARN Están compuestos por cadenas de nucleótidos Los azucares son pentosas. Las cinco bases nitrogenadas
- 28. SECUENCIACIÓN DE SANGER El método de secuenciación por dideoxinucleótidos, mejor conocido como el método Sanger se basa en el proceso biológico de la replicación del DNA. El método está basado en el empleo de dideoxinucleótidos que carecen del grupo hidroxilo del carbono 3', de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de DNA en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongándose. COMPONENTES. • DNA polimerasa. • dideoxinucleótidos • dioxinucleotidos
- 29. 1. Desnaturalización y hibridación primers SECUENCIACIÓN DE SANGER
- 30. 1. Desnaturalización y hibridación primers Uso de nucleótidos “terminator”; Con grupos fluorescentes – Grupos hidroxilos 3’ son eliminados SECUENCIACIÓN DE SANGER
- 31. 1. Desnaturalización y hibridación primers Uso de nucleótidos “terminator”; Con grupos fluorescentes – Grupos hidroxilos 3’ son eliminados 2. PCR incorpora dioxinucleotidos y dideoxinucleótidos (PCR séparadas)
- 32. 3. Separación por tamaño por electroforesis en gel o capilar SECUENCIACIÓN DE SANGER
- 33. 3. Separación por tamaño por electroforesis en gel o capilar SECUENCIACIÓN DE SANGER
- 34. SECUENCIACIÓN DE SANGER • Sanger se puede correr hasta 384 muestras • Leen bien hasta máximo de 1kb • Alrededor de 1 millón de bases al día • El genoma humano es de 6 billones de bases • Con un solo secuenciador se Requiere alrededor de 15 años para secuenciarlo completo…
- 37. Que puede haber pasado??????
- 38. Que puede haber pasado??????
- 39. •Cuantidad adecuada de ADN, del peso molecular esperado. Espectrometria: • Tener una concentración al menos de 10 ng/μl o según proveedor • Relación de absorbancias 260/280 de 1.8-2.0 por espectrometría. Requerimientos para secuenciación
- 40. Cuantificación y calidad de ADN-ARN
- 41. Pureza y cuantificación de ácidos nucleicos • Pureza del ADN o ARN extraído puede medirse por espectrofotometría https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf https://en.wikipedia.org/wiki/Nucleic_acid_quantitation Los ácidos nucleicos tienen máximo de absorbancia a 260nm (UV). El ratio 260/280 es usado y un OD ~1,8 considera"pura" una muestra de ADN; y ~2.0 se acepta como "pura" para el ARN. A 280nm sirve para evaluar contaminación por proteinas Para cuantificarA 260nm, OD = 1 A260 dsDNA = 50 µg/ml A260 ssDNA = 33 µg/ml A260 ssRNA= 40 µg/ml Nota: tambien se mide ratio 260/230 contaminación por ion fenolato, tiocianatos y otros compuestos orgánicos.
- 42. Pureza y cuantificación de ácidos nucleicos • Pureza del ADN o ARN extraído puede medirse por espectrofotometría https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf https://en.wikipedia.org/wiki/Nucleic_acid_quantitation Los ácidos nucleicos tienen máximo de absorbancia a 260nm (UV). El ratio 260/280 es usado y un OD ~1,8 considera"pura" una muestra de ADN; y ~2.0 se acepta como "pura" para el ARN. A 280nm sirve para evaluar contaminación por proteinas Para cuantificarA 260nm, OD = 1 A260 dsDNA = 50 µg/ml A260 ssDNA = 33 µg/ml A260 ssRNA= 40 µg/ml Nota: tambien se mide ratio 260/230 contaminación por ion fenolato, tiocianatos y otros compuestos orgánicos. Ratio Lectura baja Lectura alta A260/A230 •Remanente de carbohidratos (plantas) •Fenol residual de la extracción •Guanidina residual (usada a menudo en kits basados en columnas) •Glycógeno utilizado para la precipitación. • Trabajar con material o en un ambiente sucio . •Usar una solución inapropiada para la medición en blanco. La solución en blanco debe tener el mismo pH y una fuerza iónica similar a la de la solución de muestra. Ejemplo: el uso de agua para la medición en blanco de las muestras disueltas en TE puede dar lugar a relaciones bajas de 260/230. A260/A280 •Fenol residual u otro reactivo asociado con el protocolo de extracción. •Una concentración muy baja (< 10 ng/μl) de ácido nucleico. •ARN residual de la extracción de ácidos nucleicos.* Las proporciones de pureza altas de 260/280 normalmente no son indicativas de ningún problema.
- 43. Requerimientos para envio • Existe muchas casas de secuenciamento, para envió directo o indirecto. • Para el Envio se recomienda ver bien las condiciones de envio (DHL/FEDEX…) • Llenar los formatos del proveedor • Seleccionar los servicios (purificación, doble sentido…). • Packaging muy importante (calidad de los tubos, parafilm, bien identificados, que estén bien apretados). • Viajan a Temperatura ambiente. • ADNdc es muy estable. https://dna.macrogen.com/main.do#
- 44. Requerimientos para secuenciación • Ideal es realizar un gel de agarosa 0.8-1% en buffer TAE, con 1-2 µl de la muestra, • Señal no muy fuerte (tenue) • Marcador de peso molecular de alto peso molecular para observar la integridad del ADN y eventualmente comparar la cantidad de ADN. https://dna.macrogen.com/main.do#
- 46. 46
- 47. 47
- 49. Ion Torrent https://www.youtube.com/watch?v=j6u0_rmJHjg https://www.youtube.com/watch?v=U45OIWicfAw
- 50. Secuenciación Ion Torrent 50 1. Extracción del material genético 2. Corte y ligación de adaptadores 3. Adición de barcodes y adaptadores 4. Preparación de las perlas
- 51. Secuenciación Ion Torrent 51 5. Secuenciación por síntesis 6. Cambio de pH por liberación de protón, que provoca un cambio de voltaje que es especifico a cada nucleótido
- 52. Illumina https://www.youtube.com/watch?v=BimurK8vlYc https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM
- 53. 53
- 54. Secuenciación tipo Solex (Ilumina) 54
- 55. Secuenciación tipo Solex (Ilumina) 55 1. Obtención y preparación del material genético 2. Combinación con adaptadores
- 56. 3. Desnaturalización, introducción en la celda, hibridación de los adaptadores 4. Elongación, la nueva hebra esta fijada a la celda.
- 57. 5. Hibridación a otro adaptador 6. Obtención de 02 Hebras complementarias
- 58. 7. Repetición del proceso
- 59. 8. Eliminación de una de la hebra (aquí el verde) 9. Hibridación del primer para secuenciación
- 60. 10. Adición de nucleótidos ddNTPs marcados pero reversibles 11. Elongación y lectura
- 61. 10. Lectura y reconstrucción de secuencias
- 63. Concepto basado en interrupción/perturbación de flujo eléctrico forzando una hebra (ADN/RNA) a pasar a través de un nanoporo
- 65. MATERIAL Y MÉTODOS PCR Y SECUENCIAMIENTO
- 66. EXTRACCIÓN DE ADN/CUANTIFICACIÓN -Centrifugado -Sistema de vacío Concentración -Estandarización de protocolos Extracción de ADN -Resultados en la media de 147 ng/ul Cuantificación -Alto peso molecular -16S Evaluación de calidad
- 67. PREPARACIÓN DE LIBRERÍA -uso de bacrodes especificos para mezclas -Muestras individuales -Añadir 24 barcodes Pcr y barcodes -Perlas Magnéticas -Rack magnético -Pool Limpieza -Cuantificación del pool ~50-100 ng Cuantificación -Añadir Buffers necesarios para secuenciamiento Librería
- 68. SECUENCIAMIENTO -≥800 nanoporos Verificar celda -Muestra+buffers Cargar celda -Tiempo según considere Secuenciamiento -Obtener datos Basecalling/ Bioinformática
- 70. Secuenciación PACBIO 70 1. Extracción del material genético 2. Adición y ligación de adaptadores Single Molecule real time 3. Adición de primers y polimerasa 4. Insertar en celda 5. Repartición en pozos (ZMW) 6. Fixación del complejo en fundo 7. Emisión de luz a cada nucleótido insertado
- 71. Secuenciación PACBIO 71 1. Extracción del material genético 2. Adición y ligación de adaptadores Single Molecule real time
- 72. Secuenciación PACBIO 1. Extracción del material genético 2. Adición y ligación de adaptadores Single Molecule real time 3. Adición de primers y polimerasa 4. Insertar en celda
- 73. Secuenciación PACBIO 73 1. Extracción del material genético 2. Adición y ligación de adaptadores Single Molecule real time 3. Adición de primers y polimerasa 4. Insertar en celda 5. Repartición en pozos (ZMW) 6. Fixación del complejo en fundo 7. Emisión de luz a cada nucleótido insertado
- 74. PACBIO https://www.youtube.com/watch?v=ENf8tPHQnhI&t=144s https://www.youtube.com/watch?v=NHCJ8PtYCFc https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI Fluoroforo es ligado al grupo fosforo – Enzima fijada – Reacción continue en un pozo Normal Pacbio Illumina
- 75. Secuenciación PACBIO Lectura del mismo fragmento varias veces -> >99% precisión Lectura del mismo fragmento muy largo (20-200 Kb)
- 76. Futuro • Secuenciar el Genoma humano tomo 20 años, costo 3billion USD termino en 2001 • Conllevo a un genoma por 100 million USD • En 2020 un exoma cuesta 1000 USD • En unos años probablemente 100 USD? Que impacto en la sociedad? Su genoma será parte de su historial medical Prevención de salud Mejor identificación de especies (patógenos etc…) Que serán las futuras tecnologias…)
- 78. Tarea a entregar • Hacer una presentación power point de 2 a 3 laminas que explica: • Ventajas y Desventajas del secuenciamiento long reads (seceuncias largas de tamaño superiores a 500pb) contra el secuenciamiento short reads (secuencias pequeñas; inferiores a 500pb). • Nombrar al menos 2 tecnologías (Plataformas) para cada tipo de secuenciamiento. • Entregar al correo diringerb@yahoo.fr o Whassap +51 965381633 antes del 26 de julio 23h59. PEDIR CONFIRMACION DE RECEPCION
- 79. Videos y material extra https://www.youtube.com/watch?v=mI0Fo9kaWqo https://www.youtube.com/watch?v=PFwSe09dJX0 Generalidad de Secuenciación https://www.youtube.com/watch?v=jFCD8Q6qSTM Ph.D Benoit DIRINGER diringerb@yahoo.fr +51 965 381 633