PCR-RFLP

2. 1.Historia
 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por
sus siglas en inglés: Polymerase chain reaction) es
una técnica que fue concebida por Kary Mullis a
principios de la década del 80, quien obtuvo el
premio Nobel de Química en 1993.

3. 2.Definición

4. 3.Requerimientos
 Desoxinucleótidos trifosfato-dNTPs
dATP
dTTP
dGTP
dCTP

5. o Provee de nucleótidos a la reacción para la
síntesis de ADN
o Deben estar presentes en cantidad suficiente
para que se formen los ciclos
o No deben estar en exceso para que los iones
Mg2+ no esten formando complejos con los
dNTPs

6.  Cebador o primer
 Enzima ADN polimerasa termoestable
TAQ polimerasa:
o Aislada de thermus aquaticus
o Copia el ADN a 72˚C
o No posee función correctora
o Comete un error cada 10.000 nucleótidos

7.  Mg2+ (MgCl2, MgSO4)
o Es un cofactor de ADN polimerasas
o Debe haber una concentración de Mg2+ óptima
en el medio para que el proceso funcione
correctamente

8.  Una cadena molde de ADN

9.  Buffer y sales
o Buffer: mantiene el pH óptimo para que la TAQ
polimerasa actúe.
o Sales: KCl: contribuye al plegamiento correcto de
la enzima

12. 4.PCR en el laboratorio
Creación del primer
Extracción de ADN
PCR
Cuantificación y calidad del ADN

13. Creación del primer
 Los primers o cebadores son (compuestos por
oligonucleótidos específicos) son sintetizados
químicamente
Para realizar esta labor se utilizan bases de
datos universales y programas computacionales
que establecen la secuencia primer para un gen
determinado

14. Extracción de ADN
 Se extrae el ADN genómico de la muestra a
analizar, mediante kits comerciales que aseguran
alto rendimiento, pureza, y gran cantidad de ADN

15. PCR: etapas de los ciclos
2º ELONGACIÓN
1º DESNATURALIZACIÓN
3º HIBRIDACIÓN

16. 1º DESNATURALIZACIÓN
Calentamiento para la separación de las dos hebras de
ADN mediante una incubación breve (30-120s) a 95ºC
2º HIBRIDACIÓN
Enfriamiento rápido para permitir el emparejamiento del
ADN monocaterario de interés a los cebadores (10-120s)
entre 37-65ºC

17. 3º ELONGACIÓN
Es la etapa de amplificación en la que la enzima TAQ
polimerasa elonga los cebadores empleando como molde
ambas hebras originales al comenzar y los sucesivos
fragmentos en los siguientes ciclos (30-120s) entre 72-
75ºC
Además de estas etapas hay una etapa inicial y otra final en
el conjunto de todos los ciclos. En la etapa inicial se
inactivan las proteasas y nucleasas de la muestra así como
se desnaturaliza completamente el ADN de partida. En la
etapa final se prolonga la última elongación para que se
completen todos los fragmentos

18. Cuantificación y calidad del ADN
Los equipos más utilizados hoy en día son los
Nanodrop
Con un microlitro de muestra se consigue calcular
la concentración de ácidos nucleicos que hay en
dicha muestra

19. Aplicaciones de la PCR
 Huella digital genética
 Test de paternidad
 Detección de enfermedades hereditarias
 Comparación de la expresión génica
 Clonamiento de genes
 Mutagénesis
 Análisis de ADN antiguo
 Genotipificación de los polimorfismos

20.  ¿Qué es RFLP?
o Es la Técnica de Polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción (del inglés: Restriction Fragment
Length Polymorphism)
o Es una técnica de biología molecular que nos permite
detectar fragmentos de ADN de diferentes longitudes.

21. o Esta técnica se basa en la acción de las enzimas de
restricción, las cuales reconocen secuencias específicas
de nucleótidos del ADN y hacen un corte en la cadena
o Si exponemos dos cadenas que tengan diferentes alelos, el
corte de la misma enzima nos va a producir fragmentos de
ADN de diferentes longitudes.
Los polimorfismos específicos de cada alelo modificarán
el reconocimiento por parte de la enzima y por ende, su
capacidad de corte

22. 1.Metodología
 El ADN de un individuo se extrae y se purifica. El ADN
purificado puede ser amplificado usando la técnica molecular
Reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés
Polymerase Chain Reaction), luego tratado con enzimas de
restricción específicas para producir fragmentos de ADN de
diferentes longitudes
 Estas enzimas de restricción hacen un proceso de digestión
restrictiva en el cual reconocen cortas secuencias específicas en
el ADN donde cortan formando fragmentos de distintas
longitudes. Los fragmentos de restricción se separan mediante
electroforesis en geles de agarosa a través del cual corren debido
a un campo eléctrico y su disociación obedece a la masa o a la
carga eléctrica de las muestras según la técnica utilizada

23.  Esto proporciona un patrón de bandas que es único para
un ADN en particular debido a la diferencia en las
secuencias del ADN en los individuos donde los sitios de
restricción varían. Las bandas pueden ser transferidas por
Southern Blot a una membrana donde se hibridan con una
sonda que permite determinar la longitud y la separación
de los fragmentos
 Las endonucleasas de restricción en su mayoría cortan el
ADN de cadena doble en secuencias específicas y cada
enzima reconoce un sitio en particular. Un ejemplo es la
EcoRI: corta solamente cuando encuentra la secuencia
5`…G/AATTC…3` en la doble hélice. Para esta técnica,
es importante seleccionar endonucleasas que corten en
sitios específicos y no sea en secuencias degeneradas

26. Aplicaciones de la RFLP
 El análisis de la variación de RFLP en genomas ha
supuesto en el pasado una herramienta fundamental en el
mapeo genómico y el análisis de enfermedades
genéticas. También se ha usado este análisis para
determinar el origen parental de muchas trisomías en
humanos
 El análisis RFLP fue también la base de las modernas
técnicas de análisis de huellas genéticas (Genetic
Fingerprinting analysis en inglés), útiles en la identificación
de muestras recuperadas de la escena de un crimen, en
pruebas de paternidad, y en el estudio de la biodiversidad
en poblaciones animales

27. Bibliografía
 Apuntes de clase
 PCR (slideshare.net)
 Polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción – EcuRed
 Polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción - Wikipedia,
la enciclopedia libre