tecnicas de biologi molecualr

1. BIOLOGIA MOLECULAR
Bioq. Farm. Luiggi O. Solano Maza, Mg, Sc.
losolano@utmachala.edu.ec

2. UNIDAD V: Técnicas moleculares
Definir la aplicación de las técnicas moleculares mediante
ejemplificación para la identificación y análisis de
marcadores biológicos en el genoma y proteoma.

3. - Técnicas moleculares
TEMA 13
• Técnicas moleculares, generalidades
• Utilidad importante y procedimiento: Taller practico: técnicas
moleculares
OBJETIVO: Describir los conceptos y términos relacionados a técnicas
moleculares, a través del análisis bibliográfico, para conocimiento del
estudiante.
• Clasificación de técnicas moleculares

4. Las técnicas de biología
molecular sirven para
analizar ácidos nucleicos y
para detectar, e identificar
tanto microorganismos,
como diferentes genotipos
dentro de una misma
especie y genes de
resistencia al tratamiento
farmacológico.
Todas estas técnicas
necesitan un paso previo de
extracción de ADN o ARN.
Una vez extraído debe
purificarse de forma
adecuada para evitar la
presencia en la muestra de
inhibidores o sustancias que
contaminen y que impidan
la correcta realización de la
técnica posterior.
• Técnicas moleculares, generalidades

5. La extracción del ADN es el
paso más crucial en todo el
proceso relacionado con la
biología molecular.
Se suelen utilizar kits
comercializados que incluyen
el protocolo específico para la
extracción.
Los métodos de extracción de
ADN se caracterizan por la lisis
de la célula, la inactivación de
las enzimas nucleasas
celulares y la separación de los
ácidos nucleicos de los demás
restos celulares.
Pueden ser de diferentes
tipos: rotura mecánica
(trituración, lisis hipotónica),
por tratamiento químico
(detergentes, agentes
caotrópicos, reducción con
tioles) o por digestión
enzimática (proteinasa K)

6. Con los avances en la
biología molecular se han
desarrollado múltiples
equipos que realizan la
extracción de ADN
Las técnicas de biología
molecular se deben
realizar en muestras de
ADN totalmente puros,
para obtener resultados
correctos, evitando tanto
falsos positivos como
negativos.
Los métodos de
purificación del ADN
pueden basarse en
diferentes acciones:
extracción/precipitación,
ultrafiltración,
cromatografía,
centrifugación y
separación por afinidad.

7. Extracción/precipitación: tiene
lugar un primer paso en el que
se extraen contaminantes como
fenol y cloroformo de la muestra
de ácidos nucleicos extraídos, y
un segundo paso en el que se
precipitan los ácidos nucleicos
con isopropanol o etanol. Es un
método laborioso y que utiliza
productos tóxicos..
Ultrafiltración: se utiliza una
membrana que actúa de filtro
sobre la que se coloca la
muestra de ácidos nucleicos
extraídos y se somete a
centrifugación. De esta forma,
los ácidos nucleicos libres de
sustancias contaminantes
quedan retenidos en la
membrana y posteriormente se
recuperan añadiendo agua o un
tampón específico.
Ultracentrifugación: por
diferencia de densidad se
separan las partículas, las más
densas sedimentan y las menos
densas flotan. Para favorecer
este proceso se lleva a cabo la
centrifugación.
Cromatografía: se utiliza una
matriz con poros hidrofílicos que
dejará pasar las moléculas más
pequeñas. Las moléculas
grandes quedarán eluidas en el
volumen vacío por orden
decreciente.
Electroforesis: se basa en la
separación de los ácidos
nucleicos mediante gel de
poliacrilamida. Las moléculas
más pequeñas se moverán a
mayor velocidad y las más
grandes más despacio. Cuando
las moléculas de ADN son muy
grandes, se usan geles de
agarosa. En función del tamaño
de las moléculas, se pueden
usar diferentes concentraciones
de agarosa o poliacrilamida en
el gel.

8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La técnica de la PCR
consiste en la
amplificación de una
región específica de
ADN utilizando
unos primers o
cebadores (secuencias
de ADN que delimitan
la zona de
amplificación, que
tienen una longitud de
15-30 nucleótidos y
son complementarios
a la región del ADN
que se quiere
amplificar).
Se basa en la acción de
diferentes enzimas,
entre ellas la ADN
polimerasa, que
incorpora los
nucleótidos en la
síntesis de nuevas
cadenas de ADN
(amplificación).
En esta técnica se
reproduce lo que tiene
lugar en el interior de
la célula.
La muestra de ADN se
añade en un tubo
eppendorf junto con
los primers, los
desoxinucleótidos
(dATP, dCTP, dGTP y
dTTP), una ADN
polimerasa
termoestable y un
cofactor de esta
enzima (normalmente
magnesio).
Una vez introducidos
todos los reactivos
necesarios para el
desarrollo de la
técnica, se someterán
a una serie de ciclos
(25-40 ciclos), con
cambios de
temperatura
característicos y que
permitirán amplificar
la región concreta del
ADN de la muestra.

9. DNA molde.
Primers o cebadores.
Enzima DNA polimerasa.
Mg ++
Agua libre de nucleasas.
Solución buffer.
dNTPs (dATP; dCTP; dTTP; dGTP)
T
ermociclador.
REQUISITOS PARA LA PCR

10. El ADN molde puede ser de cadena sencilla o doble,
circular o lineal. En caso de desear amplificar una
secuencia de ARN se debe utilizar primeramente una
transcriptasa reversa.
El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000
nucleótidos de longitud.
No necesariamente puro, pero libre de altas
concentraciones de EDTA o cationes que pueden actuar
como quelantes.
La cantidad de ADN molde a utilizar depende de la
muestra de partida. Demasiada cantidad de ADN puede
inhibir la reacción de PCR.
ADN MOLDE

11. Deben ser específicos.
No deben presentar auto-complementariedad.
No deben ser complementarios entre ellos.
El contenido de G+C debe estar entre el 40-60%.
5´ 3´
3´ 5´
Primer reverse (rev) o antisense (as)
Primer forward (fw) o sense (se)
Longitud de la región complementaria al ADN molde de entre 18-25pb.
PRIMERS O CEBADORES

12. T
aq ADN polimerasa es
termales).
aislada de Thermus aquaticus (vive en aguas
Incorporan dNTPs por complementariedad en una cadena que sirve de
molde.
Necesitan la presencia de Mg para funcionar.
ENZIMA DNA POLIMERASA

13. Mg++ es un cofactor de DNA polimerasas
La concentración de MgCl influye directamente en la actividad de la
polimerasa, y es uno de los parámetros a ajustar:
 Muy poco – la polimerasa no funciona correctamente, afectando el
rendimiento de la reacción
Mucho – favorece el annealing de los primers a lugares que no son 100
 %
la
complementarios,
reacción
afectando la especificidad y el rendimiento de
Mg++

14. Generalmente se utilizan concentraciones equimolares de los 4 dNTPs
(dATP
, dCTP
, dGTP
, dTTP) en concentraciones que varían entre
250 μM de c/u.
200 –
No deben estar en exceso para que los iones Mg++ no estén formando
complejos con los dNTPs y no disponibles como cofactores para la
enzima. Se afecta el rendimiento de la reacción y la fidelidad del producto
final
dNTPS

15. El buffer es en general Tris base ajustado a un pH específico con HCl.
pH 8.3 es el óptimo para Taq.
El pH óptimo mantiene la enzima plegada en una conformación a la cual es
enzimáticamente activa.
SOLUCION BUFFERS

16. Un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las
muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de
los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa.
TERMOCICLADOR

17. Desnaturalización.
Hibridación.
Elongación.
PASOS DE UNA PCR

18. Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra
sencilla.

19. Los “primers”, reac ionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en
lugares específicos por complementariedad de bases.
c

20. Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, y coloca nucleótidos de
5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia
complementaria de las hebras de DNA molde

22. La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante
electroforesis.
Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que
deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a
distintas concentraciones.
La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio
(lámpara de luz UV).
Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800 pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas (primers
inespecíficos
varios sitios)
se pegan a

23. Rastreo de mutaciones.
Diagnóstico de enfermedades.
Detección de organismos infecciosos.
Medicina forense y determinación de paternidad.
Cuantificación de mRNA y DNA (PCR en Tiempo Real)
Polimorfismo de secuencia.

24. La PCR es rápida, y puede realizarse en unas pocas horas, en vez de
días, en comparación con la clonación basada en células.
El diseño de los primers para la PCR se hace automáticamente con un
programa de ordenado, y la síntesis comercial de oligonucleótidos
también es rápida y económica.
Es muy sensible y, amplifica secuencias específicas de DNA a partir de
pequeñas muestras de DNA prácticamente indetectables.
T
ambién se pueden usar muestras de DNA que están parcialmente
degradadas, que se encuentran mezcladas con otros materiales, o que
están incluida en un medio (como el ámbar), lo que sería díficil o
imposible con las técnicas de clonación convencional.

25. Se debe disponer de alguna información sobre la secuencia de
nucleótidos del DNA diana, y cualquier contaminación de la muestra con
DNA de otras fuentes, por pequeña que sea, puede causar problemas.
Por ejemplo, células desprendidas de la piel del investigador pueden
contaminar las muestras recogidas del escenario de un crimen o tomadas
de un fósil, lo que dificulta la obtención de resultados precisos.
Las PCR siempre deben realizarse con controles adecuados
cuidadosamente diseñados.

26. PCR en tiempo real o qPCR
Esta variante de la PCR añade marcadores fluorescentes con el objetivo de saber la cantidad de ADN inicial en todo momento y detectar
la presencia de variaciones genéticas.
La emisión de fluorescencia será proporcional al número de moléculas producidas, haciendo que la técnica sea cuantitativa.
Para la realización de esta técnica, además de los reactivos necesarios para la PCR convencional, se necesitan sondas marcadas con
enzimas, sustratos antigénicos, radioisótopos, quimioluminiscencia o fluorescencia, con capacidad de unión a la cadena de ácido nucleico
que se requiere amplificar.
En función del marcado de la sonda, para su interpretación se utilizarán diferentes métodos.
Se puede utilizar para la identificación de virus, bacterias y hongos.
El fluoróforo marcador más utilizado es el SYBR Green, presenta carga positiva y no emite fluorescencia si está libre pero sí lo hace al
unirse al surco menor del ADN.
Se utilizan además, sondas de hidrólisis (TaqMan)

27. Se pueden utilizar diferentes sondas fluorescentes para marcar genes de varios
microorganismos distintos, de forma que se convierte en una PCR en tiempo real múltiple. En
este sentido, la qPCR múltiple se puede utilizar para detectar, identificar y cuantificar entre otros,
la presencia de patógenos en alimentos (Campylobacter spp, Salmonella spp). Se considera una
buena elección en el análisis de calidad de los alimentos

28. Reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Es una variante de la PCR convencional en la
que la hebra molde que se utiliza es ácido
ribonucleico (ARN). A partir de esta hebra de
ARN se sintetiza ADN complementario
(cDNA) sobre el que posteriormente se
realizará la PCR convencional. Se trata pues,
de un método dividido en dos procesos, el
primero de ellos, la transcripción inversa y el
segundo, la PCR.

29. PCR digital
La PCR digital (dPCR) se trata de
una técnica ultrasensible, por lo
que en el diagnóstico de
enfermedades infecciosas puede
detectar la presencia de
microorganismos en
concentraciones muy bajas, incluso
aquellas que están por debajo del
límite de detección de la qPCR.
La dPCR proporciona una
cuantificación precisa y absoluta de
los ácidos nucleicos sin una curva
estándar y sin dependencia de la
eficiencia de amplificación.
La PCR digital funciona dividiendo
una muestra de ADN o ADNc en
muchas reacciones de PCR
paralelas individuales, depositadas
en múltiples pocillos. Aquellos
pocillos en los que se amplifique la
región diana concreta producirán
señal mediante un color, mientras
que las negativas no (se utilizan
sondas marcadas).

30. Microarrays
La técnica de microarrays o microarreglos de ADN se basa
en la hibridación de sondas cortas que se unen a secuencias
cortas de regiones concretas del ADN de la muestra
colocadas sobre un soporte sólido.
Estas sondas emitirán fluorescencia que será lo que se
detecte en un analizador.
La detección de ADN por microarrays permite analizar
simultáneamente un gran número de secuencias de ácidos
nucleicos de múltiples patógenos de una única vez.
Si el diseño del microarray es bueno, es posible identificar
genes asociados a factores de virulencia y genes que
confieren resistencia a tratamientos antibióticos.
Las sondas deben tener una alta complementariedad para
que se produzca la unión a la secuencia diana y poder
detectar concentraciones muy bajas (aumentar la
sensibilidad)

32. Secuenciación del genoma
La secuenciación del genoma consiste en determinar la secuencia completa de ADN (orden de
las bases Adenina, Citosina, Guanina y Timina) en el genoma. La secuenciación es fundamental
para determinar los aminoácidos que codifican un gen en concreto, para el diagnóstico de
enfermedades y la detección de mutaciones y resistencias a tratamientos farmacológicos. Estos
métodos de secuenciación se basan en la actividad de la enzima ADN polimerasa, que sintetiza
ADN a partir de otro fragmento de ADN produciendo su hebra complementaria. Se pueden
obtener secuencias de hasta 500 bases aproximadamente. Dentro de la secuenciación podemos
encontrar diferentes métodos, entre los cuales encontramos:
1.Secuenciación Sanger.
2.Secuencia paralela, masiva o de nueva generación (NGS).
3.Pirosecuencia.
4.Hibridación de sondas de ADN.
5.Polimorfismo amplificado aleatorio ADN (RAPD).
6.Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restricción (RFLP).

36. GRACIAS