Este documento describe varias técnicas de biología molecular, incluyendo: 1) el uso de enzimas de restricción para cortar ADN, 2) separación de moléculas de ADN mediante electroforesis, 3) secuenciación de ADN por el método de Sanger, y 4) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar segmentos específicos de ADN.

1. Técnicas de Biología Molecular

3. I. Enzimas de restricción
Análisis
DNA

4. Las enzimas de restricción fueron aisladas de bacterias; su
función natural es proteger contra DNA extraño

5. II. Separación electroforética de moléculas de DNA
(A) Geles de secuenciación (separación
de bandas con 1 nt de diferencia)
(B) Electroforesis para RFLP (sepración
entre 100 a 10000 nt)
(C) Electroforesis de campo pulsante
(separación de DNA cromosomal)
+
–
–
–
+
+

6. III. Secuenciación de DNA por el método de Sanger
No acepta elongación de la
cadena de nucleotidos por
la DNA polimerasa
• dsDNA molde (¿secuencia?)
• 4 desoxiribonucleótidos (dNTPs)
• cebador de DNA
• DNA polimerasa

8. 5’
5’
3’
3’

9. Secuenciación automatizada de DNA

10. IV. Southern Blot (detección de secuencias específicas
en muestras de DNA)
1. Aislamiento de DNA (todo el genoma)
2. Cortar con enzimas de restricción
3. Separar fragmentos por electroforesis
4. Desnaturalizar el DNA
5. Transferir a membrana de nitrocelulosa o
nylon
6. Hibridar con sonda específica
7. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de
fosforimager
Permite el análisis de genes, polimorfismos, mutaciones…

11. 1. Aislamiento de RNA (solo transcritos)
2. Desnaturalizar el RNA
3. Separar por electroforesis
desnaturalizante
4. Transferir a membrana de nitrocelulosa
o nylon
5. Hibridar con sonda específica
6. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla
de fosforimager
V. Northern Blot (detección de secuencias específicas
en muestras de RNA)
Permite el análisis de expresión genética y su regulación a nivel de RNA

12. Marcaje de un fragmento de DNA
(obtención de una sonda)
dCTP[αP32]
α
β
γ

13. Bromuro
de etidio
Sonda P32
Primero se deben separar los ácidos nucléicos (DNA o RNA) en
geles de agarosa horizontales, luego se transfieren a un soporte
de nitrocelulosa/nylon y se hibridan con la sonda

14. Hibridación entre ácidos nucléicos (reconocimiento
de secuencias con alta homología)
65oC 50oC
DNA – DNA
RNA – DNA
RNA – RNA
Muestra Sonda

15. 28S
18S
Southern Blot
Northern Blot

16. VI. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Desnaturalizar
94 ºC
Alineamiento
55-65 ºC
Polimerización
72 ºC
cebador directo
cebador reverso
Permite el análisis de genes, polimorfismos, mutaciones, facilita la secuenciación…
DNA
(genoma total)
Cebadores (específicos para el gen)

17. La amplificación es exponencial
En 40 ciclos se obtienen millones de copias del gen o fragmento
particular de interés
1
2
4 8

18. El PCR se puede utilizar como alternativa del Southern y
Northern blot
DNA: PCR
Amplificación directa
RNA: RT-PCR
1. Transcripción
reversa
(obtención de
cDNA)
2. Amplificación
por PCR
Exones +
intrones
Solo
exones

19. Pruebas de identidad

20. Mutagénesis
sitio dirigida
La mutación se incluye en
uno de los cebadores para
el PCR

21. Mutagénesis dirigida
Se pueden generar proteínas mutadas manipulando su DNA
Generalmente la mutagenesis se hace por PCR:
- Introduccion de mutacion puntual (cambio de un aminoacido por otro)
- Deleciones

22. VII. Western Blot (detección de proteínas específicas
con anticuerpos)

23. La detección de proteínas sirve para conocer:
1. Niveles de expresión (a nivel proteína)
2. Isoformas
3. Modificaciones postraduccionales
4. Tiempo de vida media y degradación
5. Localización subcelular

24. VIII. DNA recombinante
DNA A
DNA B
DNA AB
ligasa

25. Vectores de clonación
1. Plásmidos
2. Fagos
3. Cósmidos
4. Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz)

26. 1. Plásmidos
Se pueden clonar
fragmentos entre 1,000 y
10,000 nucleótidos
DNA doble cadena,
circular, origen propio
de replicación

27. Marcadores de resistencia a
antibióticos
Permiten la selección de bacterias
transformadas con el plásmido o
con el DNA recombinante

28. Otras características de los plásmidos
Sitios de clonación
múltiples:
varias enzimas de
restricción que solo cortan
una vez en el plásmido

29. Múltiples copias de DNA
recombinante
Obtención de múltiples copias de la molécula
recombinante

30. La transformación implica la introducción de DNA extraño a una
célula hospedante
Plásmido de bajo número de copias
Plásmido de alto número de copias

31. 2. Fagos

32. Bibliotecas genómicas
DNA genomico
Digestion con enzima de restriccion

33. Bibliotecas de cDNA
Cebador de oligo dT
Reverso transcripcion
Sintesis de DNA
doble cadena
RNA mensajero

34. Escrutinio de la biblioteca
con sonda

35. Bibliotecas genómicas vs. Bibliotecas de cDNA