El documento describe brevemente el proceso de secuenciación de ADN mediante el método de Sanger. Este método implica la terminación de la síntesis del ADN mediante la incorporación de didesoxinucleótidos que carecen de un grupo hidroxilo en el carbono 3', impidiendo la adición de más nucleótidos. Esto genera fragmentos de diferentes tamaños que pueden ser separados por electroforesis para determinar la secuencia de nucleótidos.

1. IT´S A LITLE BITE
COMPLICATED TO
SEQUENCE ME
SECUENCIACIÓN

2. ACTTTGTCCACGGCCTAAGCGTTTTTTGCCC
Secuenciación AGTGACTTTGTCCAAC
GTCCAACAGTTACCAAGTGACTTTGTCCAC TTTTGCCC
de genomas AGTGACTTTGTCCA ACGGCCTAAGCGTTTTTTTT
ALINEAMIENTO DE TODAS LAS SECUENCIAS Y RECONSTRUCCIÓN DEL CROMOSOMA

3. •Detección de mutaciones
Método de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual)
•Secuenciación de ADNs fósiles
Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayoría
están dañadas o degradadas)
•Diagnóstico de enfermedades genéticas
Diagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación de enfermedades hereditarias o
determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de
fecundación in vitro
•Identificación de especies y control de cruces entre animales
Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más
barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro
•Secuenciación de genomas
Conocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

4. • Técnica de Sanger para secuenciar el DNA:
• el DNA se denatura: hebras simples
• el partidor se hibrida a la hebra molde
• el DNA es sintetizado usando DNA polimerasa
5’ 3’
|||||||||||||||
3’

5. FUNDAMENTO
Las Cadenas
Polinucleotídicas crecen por
Adición de nucleótidos al
Extremo 3´ OH

6. Dideoxy Sequencing
Fred Sanger - 1977

7. ddATP ddTTP ddGTP ddCTP
DNA DNA DNA DNA
dNTPs dNTPs dNTPs dNTPs
5’
|||||||||||||||
3’ ATCATGTCATCAAGTCTAGCAC
TA
•cada fragmento
TAGTA termina en ddA
• Todos los posibles TAGTACA
productos
de la reacción TAGTACAGTA
conteniendo ddATP TAGTACAGTAGTTCA
TAGTACAGTAGTTCAGA

8. SECUENCIACION DEL DNA
METODO ENZIMATICO

10. migración
graphics taken from Cold Spring
Harbor Laboratory web site:
darwin.cshl.org/shockan.html

12. González,2007

14. 16 de Febrero de 2001
Celera Genomics
Proyecto genoma humano
La secuencia del genoma es un atajo valioso: ayuda a los
científicos a encontrar los genes más fácil y rápidamente
y sienta las bases para averiguar la función de los genes
identificados
Beneficios médicos tras el conocimiento de la
estructura de cada gen humano
1. Diagnóstico en individuos con riesgo de ser
portadores del gen de alguna enfermedad
2. Marco de trabajo para el desarrollo de
nuevas terapias, además de nuevas
estrategias para la terapia génica
15 de Febrero de 2001
Consorcio público internacional

16. SORPRESA No. 1
Gen 1 98% del genoma Gen 2
Sólo 2% del genoma son genes.

17. SORPRESA No. 2
Somos casi idénticos (2% de diferencia) a los chimpancés.

18. SORPRESA No. 3
Hay sólo 0,1% de variación genética
entre todos los seres humanos.
Pero 0,1% de 3.000.000.000 bases = 3.000.000 bases

19. La propiedad mas importante del DNA
es su secuencia de nucleótidos.
La secuenciación es la determinación del
orden de los nucleótidos.

20. Secuenciación por el método de
Maxam-Gilbert
• Esta basada en la modificación química del dna y
posterior escisión de bases específicas.
Ventaja:
El dna que se usa directamente (no requieres
ser clonado)
Desventajas:
• ha quedado en desuso por su complejidad.
• Los reactivos de este método no se pueden
adaptar para usarse en un kit biológico

21. • El método requiere el marcaje radiactivo en
el extremo 5 y la purificación del fragmento
que se requiere secuenciar.
• De esta manera las longitudes de los
fragmentos corresponden a posiciones en la
secuencia donde esta esa base

22. Métodos de terminación de la
cadena (sanger)
• Es el método más usado para la
secuenciación es el conocido
como técnica de terminación
de cadena de Sanger, la cual
se ha perfeccionado
conociéndose actualmente
como la técnica del didesoxi.
• Se denomina así por ser
necesario los
didesoxirribonucleótidos
(figura 1), que han perdido su
grupo alcohol OH del carbono
3'. En la figura 2 vemos un
nucleótido normal con el grupo
alcohol en el carbono 3'.

23. • Como "molde" se utiliza una
de las cadenas del
fragmento de ADN que se
va a secuenciar
• Como "cebador" para iniciar
la síntesis, se necesita un
corto oligonucleótido
complementario del
extremo de la cadena
• desoxinucleótidos de las
cuatro bases: dAMP, dTMP,
dGMP, dCMP.
• didesoxinucleótidos de una
base en cada una de las
cuatro reacciones de
secuenciación.

24. • Al añadir la ADN-polimerasa, comienza
la polimerización en el cebador, pero
cesa el incorporarse un
didesoxinucleótido porque la ausencia
de un hidroxilo 3’ impide el agregado del
próximo nucleotido.

25. • Deben prepararse cuatro reacciones de
secueciación, cada una con un didesoxi
distinto . Los fragmentos resultantes se
separan por tamaño mediante
electroforesis, se autorradiografían, y la
sucesión de bandas de cada una de las
cuatro reacciones, comparándolas entre
sí,dan la secuencia del ADN

27. •CYCLE SEQUENCING
•3 µl de ddH2O
•2 µl buffer 5x
•1 µl de cada cebador
•1 µl Big Dye
•3 µl de ADNmt (gelasa)

29. Automatización y preparación de las
muestras
• Más de 384 muestras marcadas por fluoresciencia de una
sola vez y 24 ciclos de secuenciación al día.
• Preparar por separado las reacciones de secuenciación
mediante una termocicladora, lavado y resuspensión en una
solución buffer antes de pasar las muestras al secuenciador.
• Limitaciones: alturas y formas de picos desiguales en los
registros del cromatograma producto de los terminadores
fluorescentes.
• Solución: introducción de nuevos sistemas enzimáticos de
polimerasas de ADN y colorantes que minimizan la
variabilidad de la incorporación..

30. TECNOLOGíA DE MICROARRAYS
DE cDNAS
CHIPs de DNA
• Permite analizar cientos o miles de genes diferentes
en un solo experimento.

31. Tipos de arrays
1. Microarrays de cDNAs:
• DNAs (cDNA o productos de PCR 0,6-2,4 Kb) son inmovilizados en
una superficie solida (nylon o vidrio).
• Contienen cientos-miles de sondas.
• Baja densidad de las sondas inmovilizadas.
• La muestra a hibridar es marcada con radioactividad.
2. 2. Microarrays de oligonucleotidos:
• Oligonucleotidos (20-80 pb) son sintetizados sobre una matriz de
vidrio o plástico.
• Contienen 40.000-60.000 sondas.
• Alta densidad de sondas inmovilizadas (107 copias/punto de
siembra).

32. Confección del array

33. Confección de arrays
MICROARRAYS
Siembra 0,25-1 nL/spot
generando spots de 100-
150 m de diametro.

34. Confección de arrays

35. Confección de arrays
Figure 3: Atomic force microscopy of DNA on a microarray. This is a micrograph of a portion of a hybridization probe from a
yeast microarray, taken after the array was subjected to hybridization. The DNA is clearly deposited at a sufficient density to
allow many kinds of strand–to–strand interactions. The width of the picture represents a scanned distance of 2 m. Image
kindly provided by J. DeRisi (Stanford) and E. Carr (Hewlett–Packard).

36. Confección de arrays
Macroarrays
Robot sembrador
Membrana de nylon
Colección de genes
blanco: DNA’s o
Productos de PCR
Siembra 7 nL/spot
generando spots de 400-800
m de diametro.

37. Hibridación en microarrays
Cy5 = 633 nm Cy3 = 532 nm
1 2
Cy5 Cy3
Expresión de 1 > 2
Expresión de 1 = 2
Expresión de 1 < 2

38. Microarray de levadura

39. El nivel de expresión de cada gen es representado por la
intensidad de la señal asociada a un color:
Rojo (Cy5) = > expresión en la muestra experimental
Verde (Cy3) = < expresión en la muestra experimental
Por convención el RNA de referencia es marcado con Cy3.