La reaccion de la cadena de Polimerasa, para amplificar un segmento de ADN, sus requerimientos, etapas del proceso, indicaciones, controles y cuales son su forma de ver su amplificacion

2. • Técnica de Biología Molecular que tiene por objetivo la
amplificación directa de un gen (o fragmento de DNA) o indirecta de
unRNA,presente enmezclas demuydiversasfuentes.
• La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática
in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica
de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia
blancoescopiadafielmente.

3. •Muestra,moldedeDNAoDNAc
•Cebadores, iniciadores,primers
•DNA polimerasatermoestable
•Ionesmetálicosclorurodemagnesio
•Desoxinucléotidostrifosfato
•Tampónyclorurodepotasio.

4. •Molécula que contiene la región de DNA que
sequiereamplificar.
•PuedeserDNAocDNA.
•Serequierepocacantidad.
•Nodebesernecesariamente puro.
•Tiene que ser libre de altas concentraciones
de EDTA o cationes que pueden actuar como
quelantes

5. • AgualibredeRNAsasyDNAsas
• Provee el medio en el cual se
llevaran a cabo las reacciones
para la replicación del material
genético

6. •Los iones de Magnesio estimulan a la enzima para
incorporarlosdNTPs(actúacomocofactor)
•Determinar la [Mg++] óptima es uno de los pasos
másimportantes enlapuestaapuntodeunaPCR.
•[Mg++] muy bajas : la polimerasa no funciona
correctamente, afectando el rendimiento de la
reacción.
•[Mg++] muy altas : favorece amplificaciones
inespecíficas, afectandolaespecificidad reacción.

7. •Provee de nucleótidos a la
reacción para la síntesis del
DNA
•Se incorpora a un DNA molde de
maneracomplementaria.
•Deben ser usados en
concentraciones equivalentes
paraminimizar loserrores

8. •Deberá tener un pH óptimo para que la
enzimaactúe.
•Las sales proporcionan la fuerza iónica
adecuadaparalaactividad delaenzima.
•Sales como KCl ayuda al plegamiento
correcto de la enzima si su valor es
menora50mM(Inhibición)

9. Secuencias cortas de DNA (oligonucleótidos) que delimitan la
zona que queremos amplificar. Deben ser complementarios a
cada uno de los extremos de la región a amplificar. Se sintetizan
in vitro de un modo preciso para que a partir de su región 3‟, la
polimerasainicielasíntesisendireccióncorrecta
Longitud:Entre18y30nucleótidos
Contenido: G+Centre40-75%

10. • La mas frecuente es la Taq polimerasa fue
aislada de la bacteria Thermus aquaticus en
1976queviveenaguas termales
• Es termoestable y actúa en la presencia de
ionesdemagnesioatemperaturas elevadas.
• Cometeunerror cada 10.000 nucleótidos.
• Su temperatura optima de actuación es a
72ºC.
• Su concentracion varia entre 1 a 2 unidades
deenzimaporcada100μL dereaccion.

11. Instrumento programado para
cambiar la temperatura de las
muestras rápidamente desde
unatemperatura aotra.

12. Tres pasos básicos
Desnaturalización
Apareamiento
Elongación
Primers
complementarios

13. •El DNA molde de doble hebra es desnaturalizado por calor a una
temperatura porencima desupuntodefusión(94a96°C.)
•Serompelospuentes dehidrogeno

14. • Se lleva a cabo por enfriamiento de la mezcla de reacción, después de la
desnaturalización40a60°C
• Pegado de primers a secuencia target Temperatura depende de primers:
muyaltapoco/nadadeproducto,muybajaproductosinespecíficos

15. • La Taq polimerasa se une al templado de DNA y comienza la polimerización, a la
temperatura optimadelaenzima.
• IncorporacióndelosdNTPsalextremo3´libre
• T°idealencadaciclo:72°C por45seg.
• La síntesis ocurre a una tasa de aproximadamente 20 nucleótidos por segundo, y en
unminutoessintetizadaunanuevacopiadelfragmentoquesequiere analizar.

17. •Degradacióndereactivos
• Inactivacióndelaenzima
• Agotamientodereactivos

18. • Al final de la PCR, para saber si la
reacción transcurrió eficientemente,
los ampliaciones son visualizados a
través de una electroforesis en geles
deagarosa.

19. • Causas defalsos positivos
• CONTAMINACIÓN!!
• Amplificacióninespecífica
• Causas defalsos negativos
• InhibidoresdelaPCRenlamuestra (ej.grupohemo,heparina)
• Extracción delADNdefectuosa
• Mutaciónenelsitiodehibridacióndelcebador
• Baja concentraciónocalidaddeltemplado
• ConcentraciónincorrectadeMg2+oprimers

20. • RT-PCR
• PCRanidada(NestedPCR)
• BoosterPCR
• PCRasimétrica
• PCRMultiplex
•PCRReversa
•SISPA-PCR
•PCRcompetitiva
•PCRen tiempo real

21. HUELLA DIGITALGENÉTICA
• Es una técnica forense que permite identificar
a una persona comparando su DNA con el de
una muestra obtenida, por ejemplo, de la
escenadeuncrimen.
• Como la muestra puede ser muy escasa, la
PCR permite aumentar la cantidad de DNA
amplificando ciertos segmentos polimórficos
(variables en la población), para luego
separarlos mediante electroforesis, lo que se
conocecomo DNAfingerprintohuelladigital.

22. Amplificando por PCR fragmentos
polimórficos de DNA de la madre, del niño y
de él o los presuntos padres, y separándolo
mediante electroforesis, se puede
visualizarunaseriedesegmentos quetiene
el niño, que debe compartir con la madre y
padrebiológicos.

23. • Cada gen en estudio puede ser amplificado fácilmente por PCR, con
los partidores adecuados, y luego ser secuenciado, para así
determinar si un individuo porta alguna mutación que explica la
presencia de una enfermedad o su aparición en el futuro, la que
puedeserheredada asushijos.

24. •Con la PCR se puede analizar DNA que
tiene miles de años de antigüedad, lo
que ha permitido estudiar muestras
obtenidas desde momias y de restos de
animales extintos, como algunos
ejemplos.

25. •Comparacióndelaexpresióngénica.
•Clonamientodegenes.
•Mutagénesis.
•Genotipificacióndepolimorfismos