El documento describe diferentes técnicas de biología molecular utilizadas para realizar diagnósticos genéticos. Estas incluyen la extracción de ADN, el uso de tarjetas FTA, la lisis alcalina, las enzimas de restricción y su uso en ingeniería genética, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y algunas de sus variaciones como la PCR anidada y la PCR en tiempo real. Además, explica conceptos como la organización de los genomas, la cromatina y las clases de genomas.

1. Bloque 2
TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

5. 2.1 Organización del genoma

7. CLASES DE GENOMAS
VIRAL
Desnudo, circular ó lineal
Hebra sencilla ó doble
RNA DNA
PROCARIOTA
Desnudo, hebra
doble,
circular, nucleoide
DNA
EXTRA
CROMOSOMICO
PLASMIDO
DNA
CROMOSOMICO
EUCARIOTA
EXTRANUCLEAR
MITOCONDRIAL
CLOROPLASTOS
DOBLE HEBRA,
CIRCULAR, DESNUDO
(SIN HISTONAS),
CORTO
-TAMAÑOS DIFERENTES
-VARIOS POR
ORGANELO
-DEPENDE DE ENZIMAS
NUCLEARES16- 18 kb
NUCLEAR:
envoltura
nuclear
LINEAL, LARGO,
COMPLEJO
MAYOR
INFORMACION
DNA + HISTONAS:
CROMATINA

12. Accesibilidad de la
molécula de DNA para
su interacción con
proteínas (DNA
polimerasas, RNA
polimerasas, factores
de transcripción, etc.)
No es accesible, debido a su
elevada condensación. Se
habla de cromatina
transcripcionalmente
inactiva. Se replica al final
de la fase S. Los genes que
contiene no se expresan
Es accesible:
Cromatina
transcripcionalmente
activa. Se replica al
principio de la fase S.
Sus genes se expresan
HETEROCROMATINA EUCROMATINA

13. TÉCNICAS DE
DIAGNÓSTICO
MOLECULAR
¿CÓMO HACEMOS HOY UN DIAGNÓSTICO GENÉTICO?

16. EXTRACCIÒN DE
ADN
La extracción del ADN es un proceso
mediante el cual hay separación del
ADN de un ser vivo de los demás
elementos celulares a través del
aislamiento del mismo.

19. TARJETAS FTA
WHATMAN
Las tarjetas FTA contienen productos
químicos que lisan las células,
desnaturalizan las proteínas y protegen los
ácidos nucleicos de las nucleasas, la
oxidación y los daños causados por
radiación UV.

20. TARJETAS FTA
“WHATMAN”
Son utilizadas para la recogida, transporte,
registro y aislamiento de ácidos nucleicos a
temperatura ambiente.

21. LISIS ALCALINA
El método de lisis alcalina se basa en la
desnaturalización selectiva del ADN
cromosómico mediante alcalinización
con NaOH y adición de SDS
(detergente), en condiciones en las que
el DNA plasmídico permanece próximo a
su estructura nativa, debido
principalmente a su pequeño tamaño y
su naturaleza circular y super enrollada.

22. Enzimas de restricción
Son endonucleasas específicas capaces de reconocer
secuencias palindrómicas de DNA y cortar los
enlaces fosfodiéster del material genético en un
punto específico.
Palindrómicas quiere decir que leen en direcciones
opuestas el mismo orden de nucleótidos.
5’ G T T A A C 3’
3’ C A A T T G 5’

24. Tipos de enzimas (endonucleasas)
de restricción
Endonucleasa Tipo I – corta lejos de la
sucuencia que reconoce, ya sea río arriba o
río abajo.
Endonucleasa Tipo II – cortan dentro de la
secuencia que reconocen.
Endonucleasa Tipo III – cortan de 5-8 bases
antes o después de la secuencia que
reconocen.

25. Enzimas de restricción
Son suceptibles a cambios en temperatura, pH, etc.
Estas enzimas se obtienen de células bacterianas.
El nombre de estas está dado de la siguiente manera:
La primera letra representa el género de la bacteria, las
próximas dos indican la especie, la cuarta letra indica la
cepa y el número al final indica el número de enzima
que se ha aislado de esa cepa.

27. Endonucleasas y Palíndromes.
La flecha indica el lugar donde la enzima corta el DNA.
Endonucleasa de restricción Secuencia de
reconocimiento
AluI AG↓CT
BamHI G↓GATCC
EcoRI G↓AATTC
HaeIII GG↓CC
HindII GTPy↓PuAC
HindIII A↓AGCTT
PstI CTGCA↓G
HpaII C↓CGG
NotI GC↓GGCCGC

29. Aplicaciones
Las endonucleasas de restricción se pueden usar en:
ingeniería genética, pruebas de paternidad o maternidad
y medicina forense, entre otras.
Ingeniería Genética.
A través de la tecnología de DNA recombinante cualquier
segmento de DNA puede ser separado de un genoma y
ligado a un genoma de otro individuo.
Esta tecnología que se comenzó a utilizar con bacterias,
les ha permitido a los investigadores estudiar con más
precisión los genes de organismos procariota y eucariota.

30. La clonación es la técnica central de la tecnología de DNA
recombinante.
permite replicar (clonar) en grandes cantidades un
pedazo específico de DNA.
El DNA de interés es cortado y ligado a un elemento
genético, vector de clonación, que se puede replicar
autónomamente cuando se introduce a una bacteria en
crecimiento, en la mayoría de los casos E. coli.
El vector de clonación puede ser un plásmido o
un bacteriófago.

31. Tanto el DNA de interés como el vector de clonación deben
ser cortados con la misma enzima.
Las enzimas más utilizadas en esta técnica son aquellas que
producen terminales pegajosos.

34. La reacción en cadena de la polimerasa, conocida
como PCR por sus siglas en inglés (polymerase
chain reaction), es una técnica de biología
molecular desarrollada con el objetivo de obtener
un gran número de copias de un fragmento
específico de ADN , partiendo de una cantidad
mínima (en teoría basta partir de una única copia
de ese fragmento original o molde).

35. REACTIVOS USADOS EN LA PCR:
*Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP),
sustratos para polimerizar nuevo ADN.
*Dos cebadores o iniciadores (en inglés,
primers), oligonucleótidos que son, cada uno,
complementarios a una de las dos hebras del
ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y
cuarenta nucleótidos, normalmente de
dieciocho a veintidós, que permiten que la
polimerasa inicie la reacción. Deben estar
enfrentados y no a mucha distancia. Delimitan
la zona de ADN a amplificar.

36. Iones divalentes.
Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado
comúnmente como cloruro de magnesio
(MgCl2), o algún otro catión divalente.
Actúan como cofactores de la polimerasa.

37. *Una solución tampón o buffer que mantiene el
pH adecuado para el funcionamiento de la ADN
polimerasa.
*ADN polimerasa o mezcla de distintas
polimerasas con temperatura óptima alrededor
de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).
*ADN molde, que contiene la región de ADN
que se va a amplificar.
*Termociclador, el aparato que mantiene la
temperatura necesaria en cada una de las
etapas que conforman un ciclo.

38. Fases de la PCR
Inicio
Este paso consiste en llevar la reacción
hasta una temperatura de 94-96 °C (ó
98 °C si se está usando una polimerasa
termoestable extrema), que se
mantiene durante 1-9 minutos. Esto
sólo es necesario para ADN polimerasas
que requieran activación por calor.

39. Desnaturalización
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se
separan las dos cadenas de las cuales está
constituido). Este paso puede realizarse de
diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95
°C) de la muestra la forma más habitual. La
temperatura a la cual se decide realizar la
desnaturalización depende, por ejemplo, de la
proporción de G+C que tenga la cadena, como
también del largo de la misma. Otros métodos,
raramente empleados en la técnica de la PCR,
serían la adición de sales o agentes químicos
capaces de realizar la desnaturalización.

40. Alineamiento o unión del cebador
La hibridación del cebador, es decir, el cebador se
unirá a su secuencia complementaria en el ADN
molde. Se baja la temperatura a 40-68 °C durante
20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el
alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables
entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo
se forman cuando la secuencia del cebador es
muy similar a la secuencia del ADN molde. La
polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el
cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los
cebadores actuarán como límites de la región de
la molécula que va a ser amplificada.

41. Extensión o elongación de la cadena
La ADN polimerasa, toma el ADN molde para
sintetizar la nueva cadena complementaria y parte
desde el cebador como soporte inicial necesario
para la síntesis del nuevo ADN. La polimerasa
sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria
a la hebra molde añadiendo los dNTP
complementarios en dirección 5'→ 3'. La
temperatura para este paso depende del ADN
polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la
temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C

42. Elongación final
Etapa única que se lleva a cabo a una
temperatura de 70-74 °C durante 5-15
minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella
se asegura que cualquier ADN de cadena
simple restante sea totalmente ampliado.
VIDEO..VideosPCR o Reacción en Cadena de la Polimerasa (audio
latino).webm

46. DEFINICIÓN:
Una vez que el uso de la PCR se masificó, a partir de la década de
1990, han surgido variantes y nuevas aplicaciones a la técnica.
Las variaciones de la PCR, son las numerosas modificaciones
derivadas del método básico inicial, con el propósito de mejorar el
rendimiento o la especificidad, adaptarse a muestras particulares,
amplificar moléculas de ARN en lugar de ADN, producir cadenas
de hebra sencilla, etc.
Variaciones de la PCR

47. Entre las variantes del PCR más importantes tenemos:
•RT-PCR
•PCR Anidada- Nested
•PCR en tiempo real
•PCR-in situ
•PCR-Inversa

51. RT-PCR
Es una variante de la PCR muy utilizada en la que se utiliza ARN
como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa
reversa (una polimerasa de ADN-ARN dependiente) para realizar
la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc).
En esta primera ronda, como cebador se pueden utilizar
hexámeros (oligonucleótidos de 6 nucleótidos de secuencia
aleatoria) que se unen al azar en cualquier región del ARN molde,
o un oligonucleótido que permite la captura y la realización del
ADNc a partir del ARNm o ARN con colas poliA.
Una vez que se obtiene el ADNc, se realiza la reacción de PCR.

53. PCR Anidada- Nested
Se trata de una técnica que aumenta la sensibilidad de la PCR.
En este caso se trabaja con 4 cebadores, en una primera ronda se
amplifica de manera convencional con los dos cebadores más
externos a la región que se desea amplificar.
El producto de este primer PCR se utiliza como molde para una
segunda ronda que utiliza cebadores internos en la región
previamente amplificada.
La desventaja de esta técnica es la posibilidad aumentada de
contaminación, y además no permite cuantificar la cantidad
inicial de ADN molde que presenta en la muestra analizada.

54. PCR anidada
Técnica muy sensible de PCR en la que el producto
de una amplificación es utilizado como molde para
realizar una segunda amplificación con cebadores
que se ubican dentro de la primera secuencia
amplificada. La especificidad aumenta porque
como es amplificación de un amplicón obtenido
previamente, los cebadores sólo van a hibridar en
un sitio dentro de la molécula y el resultado será
una única banda. Así, evitamos posibles
hibridaciones inespecíficas de los cebadores.

56. PCR in situ
La PCR in situ es realizada sobre preparaciones
fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in
situ se realiza una primera amplificación de
ADN blanco y luego detección mediante
hibridación in situ convencional con sondas de
ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse
cantidades pequeñísimas de genoma. Esta
tecnología es de gran alcance en la capacidad
de amplificar específicamente una población de
secuencias de menor representación.

57. PCR-in situ
Consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o
células, donde los productos generados pueden visualizarse
en el sitio de amplificación.
Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos.
En la técnica de PCR in situ se realiza una primera
amplificación de ADN blanco y luego detección mediante
hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN.

58. PCR múltiple
PCR en la cual se amplifica simultáneamente más de una
secuencia. Para ello, se combinan dos o más pares de
cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los
reactivos de la reacción en cantidades suficientes, para
amplificar simultáneamente varios segmentos de ADN.
Ventajas: información sobre varios locus en una sola
reacción, menor cantidad de molde para el análisis,
menor cantidad de reactivos, rápida construcción de
bases de datos. Desventajas: para llevarla a cabo
adecuadamente y sin errores, se requiere de una
cuidadosa optimización del proceso.

59. PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Es una variante de la PCR en la que usamos ARN
como molde inicial, y emplea una transcriptasa
inversa para realizar la síntesis de un ADN
complementario al ARN (ADNc). De esta forma,
el desarrollo inicial de una RT-PCR sería:
1.er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
2º paso: amplificación a partir de la primera
hebra de ADNc.
3.er paso: PCR estándar.

60. PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)
Reacción de PCR cuya principal característica es
que permite cuantificar la cantidad de ADN o
ARN presente en la muestra original, o para
identificar con una muy alta probabilidad,
muestras de ADN específicas a partir de su
temperatura de fusión (también denominado
valor Tm, del inglés melting temperature).

62. ADN Recombinante
Función
Se lo utiliza en estudios
sobre la expresión génica,
regulación de la
producción comercial de
síntesis de proteínas
La tecnología de ADN
recombinante es el
conjunto de técnicas
que permiten aislar un
gen de un organismo,
para su
posterior manipulación
e inserción en otro
diferente
Al introducirse este ADN
recombinante en un
organismo, se produce
una modificación
genética que permite la
adición de una nueva
secuencia de ADN al
organismo, conllevando a
la modificación de rasgos
existentes o la expresión
de nuevos rasgo
Es una molécula que
proviene de la unión
artificial de 2
fragmentos de ADN

63. ARN Recombinante en la
Medicina
de importantes avances
terapéuticos como por
ejemplo la producción de
insulina recombinante
Permite además la posibilidad de
utilizar plantas y alimentos
transgénicos, así como
microorganismos modificados
genéticamente para producir fármacos
como: la insulina humana, la hormona
del crecimiento, interferones, la
obtención de nuevas vacunas o la
clonación de animales.

64. Clonación
Es el proceso por el cual se reproducen de manera
idéntica dos o más células en algún organismo vivo.
Este proceso puede darse de manera natural así como
también de manera artificia
CLONACIÓN CELULAR Se destaca este tipo de
clonación debido a que de una sola célula se puede
formar una cierta población de esta mismo
CLONACIÓN DE ORGANISMOS Es un tipo de
reproducción asexual en donde se reproduce o se
forma una copia de un organismo ya existente con la
misma formación genética
CLONACIÓN DE ORGANISMOS DE MANERA ARTIFICIAL
Dona su material genético (ADN) y lo recibe un ovocito que
se encuentra en su meiosis II en el citoplasma y a la cual se
le han retirado sus cromosoma

66. Northern blot
Es una técnica de detección de moléculas de ARN de una secuencia
dada dentro de una mezcla compleja.
Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en
gel a fin de separar los fragmentos de acuerdo con su tamaño. Tras
esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana
cargada positivamente en la que se efectúa la hibridación de una sonda
molecular marcada radiactiva o químicamente.

67. Aplicaciones
El ensayo Northern permite observar un patrón particular de expresión
genética entre tejidos, infecciones causadas por patógenos y durante el
curso del tratamiento de las mismas. Esta técnica se ha utilizado para
mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes
oncosupresores en células cancerosas cuando son comparadas con tejidos
normales.
La variación en el tamaño del producto de un gen puede además
indicarnos deleciones o errores en el proceso de transcripción. Alterando la
sonda podemos conocer la secuencia e incluso determinar que región del
RNA ha sido delecionada.

68. Southern blot
es un método de biología molecular que permite detectar la presencia
de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido
nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel
de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su
longitud y, después, una transferencia a una membrana en la cual se
efectúa la hibridación de la sonda.

69. Diagnóstico molecular de
enfermedades
El Southern Blot es una técnica que puede proveer información que
puede ser usada para el diagnóstico molecular de algunas
enfermedades génicas, ejemplo de ellas serían el Síndrome de
Angelman, Síndrome de Prader-Willi y Síndrome X frágil. Esta técnica
resulta ser la más sensible para el diagnóstico de algunas patologías
como es el caso del Síndrome Angelman y el Síndrome de PraderWilli.
Otra enfermedad que también puede ser diagnosticada por el Southern
Blot es el Síndrome de X frágil, el uso de esta técnica para esta
enfermedad permitirá cuantificar el número exacto de repeticiones y
metilaciones, causantes de la enfermedad.

70. Western blot
Es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en
una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un
extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las
proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso
molecular, estructura, hidrofobicidad, etc.

71. Diagnóstico
Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el
Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un
resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una población
donde la prevalencia del virus es muy baja. Mediante el Western blot se
buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano.
Se transfieren a una, el Western Blot se utiliza para diagnosticar
enfermedades infecciosas, más frecuentemente famoso, el VIH. membrana
las proteínas de células que, se sabe, están infectadas por el VIH
Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina,
comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".
Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western
blot.

72. Bibliografía:
*Herráez Angel (2012), Biología Molecular e Ingeniería Genética 2da
ed.
*Karp Gerald (2014) Biología celular y molecular 7ma ed.
*Diplomado en Genética Médica. Universitat de Valencia-España.
*Universidad Católica de Cuenca. Carrera de Medicina. Biología
Molecular. Segundo ciclo F y G. Trabajos autónomos de los siguientes
alumnos: Ronald Chalaco, María Belén Tobar, Bryan Jara, Iván
Valladolid, Karen Ordoñez, Carlos Quintuña.