El documento resume diferentes técnicas de biología molecular utilizadas para extraer, almacenar y analizar ADN, incluyendo la extracción de ADN de muestras biológicas, el almacenamiento a bajas temperaturas, el Southern blot para detección de secuencias específicas, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificación de fragmentos, y la secuenciación del ADN mediante terminadores de cadena.

1. Seminario Genética Técnicas de Biología Molecular

2. 1º Extracción de ADN Se pueden tomar diferentes fuentes para extraer ADN humano: Sangre, Saliva, Semen, hisopado vaginal, restos de fluidos en ropa, orina, piel, bulbo piloso, muestras biospsias de órganos/tejidos, material cadavérico (ej huesos), etc Se separa el ADN de otras fases orgánicas celulares:

3. El ADN purificado refrigerado a 4 ° C se conserva hasta un máximo de 3 años. Aquellas muestras que necesitan mantenerse más de 3 años deberán congelarse a -70 ° C. 2º Almacenamiento y conservación del ADN:

4. Las técnicas desarrolladas utilizan: Fundamentos: Complementariedad de bases Replicación del ADN Herramientas: Elementos de virus y bacterias (Ejemplo: Transcriptasa Reversa, Enzimas de Restricción, Polimerasas, etc.)

5. Las técnicas pueden ser Directas o Indirectas Fragmento de ADN El sector azul representa una secuencia conocida dentro fragmento de ADN El sector azul es una secuencia conocida que esta ligada/asociada a la presencia del sector que quiero buscar y desconozco su secuencia especifica (en verde) Detección ADN Directa Indirecta

6. Sólo veremos Técnicas Directas: Southern Blot PCR Secuenciación Directa Fundamentos: Complementariedad de bases Replicación del ADN

7. SOUTHERN BLOT Edwin Southern desarrolló esta técnica en 1975

8. Sirve para detectar por Hibridación la presencia de una porción de ADN en una muestra Fundamento: COMPLEMENTARIEDAD DE BASES Se diseña una sonda con nucleótidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado . El sector de ADN buscado puede ser un gen, o parte del mismo. Se puede utilizar para el diagnóstico molecular de patologías genéticas Southern Blot

9. HIBRIDACIÓN: La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena) Los nucleótidos de la sonda está marcados P 32 (radiactivos): Si al revelar hay marcador radiactivo presente, está en la muestra analizada la secuencia complementaria a la sonda Southern Blot

10. Para poder realizar Hibridación en una muestra de ADN se necesitan realizar los siguientes pasos

11. Pasos: Previos a la Hibridación: separación de fragmentos Extracción de ADN Fragmentar el ADN en porciones más pequeñas (Enzimas de restricción) Separo los fragmentos realizando una corrida electroforética usando como sustrato de migración un gel (separación por tamaño)

12. Pasos: Previos a la Hibridación: Inmovilización de los fragmentos en soporte sólido Desnaturalización con solución alcalina (SIMPLE CADENA) Transferencia a soporte sólido (membrana de nylon / nitrocelulosa): Por capilaridad o por electroforesis: pasan del gel a la membrana Se agrega solución (NaCl) para evitar rehibridación previa a colocar la sonda

13. Sacado de los bocetos de Edwin Southern antes de la publicación de la técnica

14. Pasos: Hibridación Se agrega la sonda sobre la membrana y se incuba Se lava para quitar el máximo de hibridaciones inespecíficas Se revela por autoradiografía

15. Sólo veremos Técnicas Directas: Southern Blot PCR Secuenciación

16. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa Kerry Mullis en 1983 desarrolló esta técnica

17. Amplificación de un gran número de copias a partir de un fragmento molde de ADN, utilizando una reacción enzimatica simple de polimerizacion in vitro PCR ADN molde PCR ADN resultante

18. Fundamento: REPLICACION DEL ADN COMPLEMENTARIEDAD DE BASES Herramientas: POLIMERASA BACTERIANA Estrategia: Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y renaturalizar las hebras de ADN complementario PCR

19. 1. Desnaturalización: 94°C - 96°C 2. Alineación: temperatura variable 3. Extensión: 68 - 72°C PCR: la reacción se divide en 3 pasos LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE REPETIRSE VARIAS VECES

20. Necesitamos en este proceso controlar la temperatura: termociclador Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias Extensión de la cadena 75 ºC Primer Ciclo Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias Desnaturalización 95°C Hibridización 50-60 ºC 2 do Ciclo 95ºC 50 - 60ºC 75ºC

21. ¿Qué elementos son necesarios para la polimerización in Vitro? Extracción del ADN molde Preparado de la MIX: Agua libre de nucleasas 􀁺 Catión divalente ( MgCl2 ) 􀁺 Desoxinucleótidos ( dNTP´s ) 􀁺 Sol. amortiguadora y sales ( Buffer 10X) 􀁺 Oligonucleótidos ( Primers ) 􀁺 Enzima termo-resistente (Ej: Taq Polimerasa )

22. Para la polimerización de ADN es necesario: Una polimerasa, primers y nucleótidos . Como se utiliza cambios de temperatura para lograr la desnaturalización y renaturalización de las hebras: la enzima tiene que ser resistente a cambios de temperatura ¿Qué elementos son necesarios para la polimerización in Vitro?

23. Thermus aquaticus se descubrió en el Parque Yellowstone, inició el campo de la biología de los hipertermófilos. Thermus aquaticus , crece a 70º grados (fuente de la enzima taq polimerasa usada en la PCR) PCR

24. La taq polimerasa no es la única enzima usada en la PCR. Hay muchas más Ej: PFU (enzima extraída de Pynococus Furioso) PCR Velocidad 500 nucleótidos/ min. Velocidad 2000 nucleótidos/ min. Tiene actividad 3’ exonucleasa No tiene actividad 3’ exonucleasa. Puede copiar con errores PFU TAQ

25. Complementariedad durante la hibridación en la fase de alineamiento Se unen zona donde la secuencia es complementaria Son diseñados los primers: esto permite seleccionar que porción amplificar PCR: Primers

26. PCR: Ejemplos de utilización PCR en diagnóstico: Colocando primers FF diferentes (una para secuencia normal y otra mutada) y mismo RW en el mismo tubo Combinando a PCR cortes con enzimas de restricción

27. El siguiente es el resultado en un gel de agarosa En la calle (1) se sembró el marcador de peso molecular En la calle (2) se sembró una muestra conocida para una mutación homocigota En la calle (3) se sembró la muestra del paciente

28. El siguiente es el resultado en un gel de agarosa En la calle (C1) muestra conocida homocigota gen mutado En la calle (C2) muestra conocida homocigota gen normal ¿Qué resultados dieron las muestras 1, 2, 3, 4?

29. ¿Qué elementos son necesarios para la polimerización in Vitro? Extracción del ADN molde Preparado de la MIX: Agua libre de nucleasas 􀁺 Catión divalente ( MgCl2 ) 􀁺 Desoxinucleótidos ( dNTP´s ) 􀁺 Sol. amortiguadora y sales ( Buffer 10X) 􀁺 Oligonucleótidos ( Primers ) 􀁺 Enzima termo-resistente (Ej: Taq Polimerasa )

30. Los iones de magnesio estimulan a la enzima Taq Polimerasa para que incorpore los dNTP´s. Algunas aclaraciones… Sol. amortiguadora PCR: 􀁺 Mantiene el pH óptimo para que la enzima actúe 􀁺 Sales Proporcionan la fuerza iónica adecuada para una máxima actividad de la enzima, influyen temperatura desnaturalización y de hibridación Taq Mg

31. Herramientas: POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tº Estrategia: Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y renaturalizar las hebras de ADN complementario PCR: cómo ve el observador el proceso MIX + ADN

32. Sólo veremos Técnicas Directas: Southern Blot PCR Secuenciación

33. Secuenciación: Método enzimático 1977: Frederick Sanger desarrolló esta técnica Método de los terminadores de cadena o dideoxi

34. Fundamento: REPLICACION DEL ADN COMPLEMENTARIEDAD DE BASES Herramientas: Dideoxinucleotidos Estrategia: Cuando se agrega un dideoxinucleotido a la cadena en formación se interrumpe la polimerización Secuenciación

35. En la polimerización del ADN H P O OH OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N Azúcar Base Fosfato 3 ’ 5’ 2’ 1’ 4’ Jerárquico OH del carbono 3

36. Secuenciación: utiliza deoxinucleotidos y dideoxinucleotidos H P O OH OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N Azúcar Base Fosfato 3’ 5’ 2’ 1’ 4’ H 2’3’-dideoxinucleótido monofosfato H P O OH OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N Azúcar Base Fosfato 3’ 5’ 2’ 1’ 4’ deoxinucleotido monofosfato

37. Cuando se incorpora un dideoxinucleótido se interrumpe la polimerización H P O OH OH HO O O CH 2 NH 2 N N N N Azúcar Base Fosfato 3’ 5’ 2’ 1’ 4’ H 2’3’-dideoxinucleótido monofosfato

38. Se realizan 4 reacciones de síntesis (4 tubos separados) Se incluyen pequeñas cantidades de dideoxinucleotidos ddNTP que compiten con los dNTP. En cada tubo se colocan: dNTP (4 tipos ), un solo tipo de ddNTP por tubo , primer o cebador marcado, ADN molde a secuenciar, Polimerasa A ddNTP C ddNTP G ddNTP T ddNTP

40. Los productos de las 4 reacciones, cada una conteniendo una pequeña cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, son cargadas en el gel y sometidas a electroforesis Como la polimerización es solo en dirección 5’ a 3’, los fragmentos más cortos estarán en 5’ y los más largos que se encontrarán en la dirección 3 ’ Secuenciación: Separación de fragmentos ddTTP ddCTP ddGTP ddATP Lectura 5’ a 3’ desde la basa al tope

41. ► Alternativa del método Sanger ► Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reacción ► Los productos se detectan durante electroforelectroforésis al pasar por un láser que excita los fluorocromos y se detecta fluorescencia emitida ► Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas Se coloca el cebador marcado, polimerasa , dNTP y ddNTP ► Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en único tubo SECUENCIACION AUTOMATICA empleando método enzimático

44. + Big Hairy Computer … . . Placa caliente Pol. líquido A TT G C A Laser Prisma Detectores - Ventana Reacción Secuencia Capilar

45. ¿Cómo se ve el resultado?

46. En el electroferograma se observa dos picos en la posición 152 (G / A)