La técnica de T-RFLP involucra 5 pasos principales: 1) aislamiento de ADN de la comunidad microbiana, 2) amplificación del gen 16S rRNA a través de PCR, 3) digestión del ADN amplificado con enzimas de restricción, 4) separación electroforética de los fragmentos de restricción terminales, y 5) análisis comparativo de los perfiles de fragmentos para estudiar la estructura y dinámica de la comunidad microbiana.

1. Análisis De Comunidades
Microbianas Por Polimorfismo De
Longitud De Fragmentos De
Restricción Terminales (T-RFLP)
PRESENTADO POR:
Lina María Parra Quitian
Jessika Disney Giraldo

2. • T-RFLP es una técnica utilizada para estudiar
las comunidades microbianas complejas sobre
la base de la variación en el gen 16S rRNA.
T-RFLP se puede utilizar para:
• Examinar comunidades microbianas
• Estructura y dinámica de la comunidad
• Poblaciones bacterianas en sus hábitats
naturales
Genetica y Biologia Molecular
T-RFLP

3. • Aislamiento y purificación de ADN
• Amplificación por PCR y digestión con enzimas
de restricción
• Separación y detección de la productos
digeridos a través de electroforesis
• Análisis de los datos para generar el perfil
fragmento para cada muestra
• Agrupación de análisis basado en el perfil de las
muestras
Genetica y Biologia Molecular
T-RFLP COMPRENDE CINCO PASOS
PRINCIPALES:

4. AISLAMIENTO DEL ADN DE LA COMUNIDAD
Retirar las células del sustrato y
Realizar Lisis
Método IndirectoMétodo directo
• El DNA se extrae
directamente del suelo
solido .
• Tratamientos con lizosima
• SDS
• Cambios de temperatura
extrema
• Separar las células del
suelo.
• Lisis de la suspensión
celular para maximizar la
liberación de DNA.
Finalmente se extrae el ADN de las células rotas

5. • Se utiliza rRNA 16S
• Secuencias que se han mantenido bastante
uniformes a lo largo de la evolución
• Se ven claramente las diferencias entre los
distintos microorganismos y se pueden realizar
árboles filogenéticos (clasificar)
SELECCIÓN DE CEBADORES

6. Genetica y Biologia Molecular
PCR - AMPLIFICACION
La técnica de PCR tiene diferentes aplicación una de ellas es en T-RFLP:
• Generan, bandas de DNA que son resueltas mediante electroforesis en gel.
• “huellas digitales” (del inglés, “fingerprints”).
• Pueden distinguirse especies, variedades e incluso individuos.
La amplificación in vitro del DNA se logra en tres pasos básicos:
• Separar las dos cadenas
que componen la doble
hélice del DNA.
•94oC, durante, 1 minuto
DESNATURALIZACIÓN DEL DNA
A COPIAR (MOLDE O DIANA)
• pequeñas secuencias de
DNA de cadena sencilla se
unan a sus secuencias
•
•40-60ºC oscila entre ½
minuto y 2 minutos.
HIBRIDACIÓN O
APAREAMIENTO DE LOS
CEBADORES U OLIGOS AL DNA
MOLDE
• Se duplica el número inicial
de moléculas de DNA.
•
•72 oC y se deja actuar a la
Taq polimerasa durante 1 ó
2 minutos.
COPIA DE LAS CADENAS
DELIMITADAS POR LOS
CEBADORES. V

7. • Algunos productos de PCR pueden ser
perjudiciales para las etapas posteriores del
análisis.
• Por lo tanto, los productos de PCR se purifican.
con el objetivo de eliminar proteínas,
oligonucleótidos y restos de primers.
LA PURIFICACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR

8. DIGESTION DEL DNA CON ENZIMAS DE
RESTRICCIÒN
Genetica y Biologia Molecular
. Estas enzimas de
restricción hacen un
proceso de digestión
en el cual reconocen
cortas secuencias
específicas en el
ADN donde cortan
formando fragmentos
de distintas
longitudes.
USOS
Para la realización
de mapas físicos
Huella genética ó
fingerprinting
Búsqueda de
polimorfismos

9. DIGESTION CON ENZIMAS DE
RESTRICCION
• Asegurarán de que los fragmentos de
restricción sean legítimos.
• La actividad enzimática debe ser matado
por calentamiento.
• Se almacena la muestra a -20 ° C hasta la
electroforesis.
• El producto de digestión se puede cargar
directamente sobre el gel.
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10. SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE
RESTRICCIÓN
• Se utilizan los extremos del fragmento de
DNA para realizar una replicación
específica.
• Fragmentos terminales se separan en un
gel de desnaturalización.
• Electroforesis
Genetica y Biologia Molecular

11. ANALISIS COMPARATIVO DE LA
COMUNIDAD
• Software que hacen referencias a los perfiles de
T-RFLP con una base de datos de secuencias.
• Los resultados se guardan en archivos que
contienen los datos de la exploración tabulados
y una presentación gráfica.
• Software relativos a las normas de tamaño
GeneScan (ABI), GeneFlo (Chimerix), y
MegaBACE ET (Amersham Biosciences).
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12. ENFOQUES ANALAITICOS
• ( crude similarity)
similitud crudo
• (Cluster analysis approaches)
enfoques de análisis de racimo
• (Ordination)
ordenación
• (presumtive phylogenetics)
filogenética presuntiva
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13. CONCLUSIONES
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