El documento describe diferentes métodos de secuenciación de ADN, incluyendo el método de Sanger basado en terminación de cadena, secuenciación automática, shotgun sequencing, y métodos de nueva generación como secuenciación por síntesis de Illumina y pirosecuenciación de 454. Explica cómo cada método funciona a nivel molecular y sus aplicaciones en genómica, metagenómica y transcriptómica.

1. Técnicas de Secuenciación de
DNA

2. Actualmente

3. Secuenciación de DNA
Método enzimático de terminación de cadena
(método dideoxi de Sanger)
• Polimerización interrumpida de ADN
• Se lleva a cado polimerización de ADN en
presencia de derivados dideoxi que detienen la
polimerización en diferente momento,
obteniéndose fragmentos de diferente tamaño.
• Se examinan en electroforesis, se “lee”
secuencia directamente del gel

4. Método dideoxi de Sanger

5. Método dideoxi de Sanger (2)

6. Método dideoxi de Sanger (3)

7. Método secuenciación automática

8. Electroferograma de la secuenciación
automática

9. Geles de secuencia
Secuencia automática Secuencia Manual

10. Sanger
• 1982: F. Sanger – Shotgun Sequencing
• 48.502 Nucleótidos - Primer Fago Secuenciado
• Se agrega un nuevo protocolo.

11. Shotgun Sequencing

13. 1987 - Primera Secuenciadora
• ABI 370

16. Phred Quality Values
• Phred : Software que realiza el basecalling.
Q = -10 log(Pe)
Phred quality
score
Probability that
the base is called
wrong
Accuracy of the
base call
10 1 in 10 90%
20 1 in 100 99%
30 1 in 1,000 99.9%
40 1 in 10,000 99.99%
50 1 in 100,000 99.999%

17. Ejemplo Output Phred

18. ESTs
• Se capturan los
mRNA
• mRNA -> cDNA
• Se ensamblan los
transcritos
• Transcriptoma

19. Next Generation Sequencing

20. Introducción a la SBS
• Secuenciación por Síntesis
• Enzimas:
– Ligasa
– Polimerasa
• Tipo:
– Single Molecule
– Basada en ensamble
• Ejecución:
– Tiempo Real
– Controlada Sincrónicamente

21. Secuenciación Por Síntesis
• Solexa/Illumina:
– Polimerasa, Sincrónica, Basada en Ensamble

22. • Se fragmenta el DNA
• Se reparan los
extremos
• Se agregan los
adaptadores
Illumina - SBS

23. • Se agrega el DNA a la
placa
• Se hibrida
aleatoriamente con los
adaptadores que estan
en la placa
Illumina - SBS

24. • Se agregan NTPs sin
marcar y DNA
polimerasa.
• Comienza la
amplificación
Illumina - SBS

25. • Se denatura el DNA y
se vuelve a realizar la
amplificación puente.
• Se han generado
millones de Clústers en
la placa.
Illumina - SBS

26. • Se agregan los dNTPs,
cada uno posee un
fluoroforo de color
particular:
– G - Amarillo.
– C – Azul
– A – Rojo
– T - Verde
• Se excita con un laser y
se captura una imagen.
Illumina - SBS

27. • Se excita con un laser y
se captura una imagen.
• La imagen capturada
en una posición
específica corresponde
al primer nucleótido.
Illumina - SBS

28. Illumina - SBS

29. • Los ciclos de
secuenciación se
repiten hasta
determinar la
secuencia del
templado. Una base a
la vez.
Illumina - SBS

31. Secuenciación Por Síntesis
• Roche 454 - Pirosecuenciación:
– Polimerasa, Sincrónica, Basada en ensamble.

32. • El DNA es Nebulizado
• Se fragmenta en
tamaños aleatorios
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

33. • Se agregan
adaptadores
universales (Adaptador
A’ y B’) a los Extremos
• Se denatura
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

34. • Cada Perla ‘bead’
contiene miles de
adaptadores, pero solo
se le adhiere
un fragmento de DNA
que queda atrapado en
una emulsión que
contiene en su interior
los elementos para una
PCR.
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

35. • El DNA se amplifica en
esta emulsión
Generando cientos de
copias en cada perla
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

36. • Estas son puestas en la
PicoTiter Plate (PTP). El
diseño de esta permite
una bead por orificio.
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

37. Roche 454- Pirosecuenciación - SBS

38. 454 summary
 Run time: 8 Hrs
 Produce 100's Mb of seq
 Read length: 300bp – 400bp 2011 → 740bp!!!
Applications and Challenges
 De novo sequencing
 Metagenomics
 Gene expression
 Variation detection
 Homopolymers problem

39. Secuenciación Por Síntesis
• ABI - Secuenciación por Ligación:
• Ligasa, Sincrónica, Basada en ensamble.

40. Sequenciación por Ligación - SBS

42. Secuenciación por Semiconducción
• Ion Torrent

43. Secuenciación por Semiconducción
• Al incorporarse un
núcleotido a la
hebra de ADN, la
polimerasa libera un
ion Hidrógeno.

44. Secuenciación por Semiconducción
• Matriz de alta
densidad de pozos
que permiten
generar este
proceso
paralelamente
• Cada pozo secuencia
una hebra.

45. Secuenciación por Semiconducción

46. Secuenciación por Semiconducción

47. Secuenciación por Semiconducción

48. Comparación Métodos

49. 454
Vibrio parahaemolyticus
Phred
Qual

50. Phred
Qual
Ion Torrent - Vibrio parahaemolyticus

51. Aplicaciones – Tecnologías de
Secuenciación
• De novo Genome Assembly
• Secuenciación completa del genoma de un
organismo, sin referencia previa.

52. Aplicaciones – Tecnologías de
Secuenciación
• De novo Genome Assembly (454 o Illumina)
• Secuenciación completa del genoma de un
organismo, sin referencia previa.
• Tamaño del Genoma
• Coverage esperado
• Coverage real
• Complejidad del Genoma
• Capacidad de Cómputo

53. Panda Genome
• 2.25 Gigabases -> 2.250.000.000 de
núcleotidos cubrieron el 94% del genoma.
• Sólo se utilizo Illumina.
• Se utilizaron especies de referencia para
formar los cromosomas.

54. Aplicaciones – Tecnologías de
Secuenciación

55. Aplicaciones – Tecnologías de
Secuenciación
• Metagenómica (454)
• Estudio de los metagenomas, secuenciación
del material genetico obtenido desde el
ambiente / organismo.
• Clasificación Taxonómica
• Perfil Metabólico

56. Aplicaciones – Tecnologías de
Secuenciación
• Metagenómica

57. Aplicaciones Tecnologías de
Secuenciación
• Genome Mapping (Illumina / SOLiD)
• Secuenciación con referencia, permite
identificar variantes inter/intra especies.
Variaciones estructurales, cambios en los
genomas.
• SNPs
• Variantes estructurales

58. Aplicaciones Tecnologías de
Secuenciación
• RNA –Seq Mapping (Illumina / SOLiD)
• Identificar expresión diferencial,
secuenciación del transcriptoma en diferentes
condiciones
• Expresión Diferencial
• SNPs
• Isoformas

59. Aplicaciones Tecnologías de
Secuenciación
• RNA –Seq De novo (Illumina)
• Identificar expresión diferencial, secuenciación
del transcriptoma en diferentes condiciones,
reconstrucción del transcriptoma en un
organismo, condición específico
• Obtención transcriptoma
• Expresión Diferencial
• SNPs

60. Gracias

61. Illumina –Fluorescent Reverse
Terminator