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- 9. Bioinformatica: Omas yOmicas Genomica Secuencias primarias (DNA, RNA) Replicacion ADN Bases de datos (BD), algoritmos Genomas Estudios de evolución molecular Trascripción Transcriptomica(Genomica Funcional) Datos de expresion (Microarray data) ARN BDs, herramientas de analisis Traducción Proteomica Secuencias de proteina y estructuras espectometría de masas, rayos-X, Proteína cristalografia Modificaciones post-transduccionales Biologia de sistemas Fenotipo (metabolòmica) flujos metabólicos Interactómica redes de interacción
- 10. Genómica y genomas Es el estudio de la secuencia estructura y funcion del genoma Especies Conocidas Evolución de los genomas secuenciados en los últimos años Año Numero de Geomas secuenciados 1994 0 1995 1 Enero 2011 1780 Eucariotas 272 (41 mamiferos) Bacterias 1518 Arqueobacterias 81
- 11. Projecto: Genoma Humano Projecto Internacional 15 Febrero 2001 Determinar la secuencia genomica humana y de otros oganismos modelo Tiempo y coste han sido los factores limitantes
- 12. Etapas en elproyecto genoma 1991..Human Genome Project begins 1994-1996..genetic maps 1995-1998..physical maps 1998..DNA sequencing begins 2000...Rough draft DNA sequence 2003…Complete DNA sequence 2005…...Gene map complete
- 13. Evolución del Costey tiempo necesario para la Secuenciación 2001: Human de Genomas Genome Project 2.7G$, 11 years 10 2007: 454 8 Log10(price) 1M$, 3 months 2008: ABI SOLiD 6 60.000$, 2 weeks 2010: 5000$, 2001: Celera a few days? 4 2009: Illumina, 100M$, 3 years Helicos 40-50000$ 2 2012: 100$, <24 hrs? 2000 2005 2010 Year 13
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- 20. Bases de DatosBiológicas ¿Qué es una base de datos? ¿Qué tipos de datos hay disponibles? ¿Qué es el esquema Genbank ? ¿Cómo es una entrada de datos en una BD biologica? ¿Cómo se usan?
- 21. ¿Que es unabase de datos? Es una colección de datos que tiene que ser: ◦ estructurada ◦ buscable ◦ actualizaciones regulares ◦ links y referencias a otras colecciones de datos
- 22. Algunas Bases dedatos Biológicas AATDB, AceDb, ACUTS, ADB, AFDB, AGIS, AMSdb, OMIA, OMIM, OPD, ORDB, OWL, PAHdb, ARR, AsDb, BBDB, BCGD, Beanref, PatBase, PDB, Biolmage, PDD, Pfam, PhosphoBase, PigBASE, PIR, PKR, PMD BioMagResBank, BIOMDB, BLOCKS, PPDB, PRESAGE, PRINTS, ProDom, Prolysis, BovGBASE, PROSITE, BOVMAP, BSORF, BTKbase, CANSITE, CarbBank, PROTOMAP, RatMAP, RDP, REBASE, RGP, SBASE CyanoBase, dbCFC, dbEST, dbSTS, DDBJ, DGP, SCOP, SeqAnaiRef, SGD, SGP, SheepMap, Soybase DictyDb, SPAD, SRNA db, SRPDB, STACK, StyGene,Sub2D Picty_cDB, DIP, DOGS, DOMO, DPD, DPlnteract, SubtiList, SWISS-2DPAGE, SWISS-3DIMAGE, ECDC, SWISS- ECGC, EC02DBASE, EcoCyc, EcoGene, EMBL, MODEL Repository, SWISS-PROT, TelDB, TGN, EMD db, tmRDB, ENZYME, EPD, EpoDB, ESTHER, FlyBase, FlyView, TOPS, TRANSFAC, TRR, UniGene, URNADB, V GCRDB, GDB, GENATLAS, Genbank, GeneCards, BASE, Genline, GenLink, GENOTK, GenProtEC, VDRR,VectorDB, WDCM, WIT, WormPep,YEPD GIFTS, YPD, Micado, MitoDat, MITOMAP, MJDB, MmtDB, Mol- YPM, etc .................. !!!! R-Us, MPDB, MRR, MutBase, MycDB, NDB, NRSub, 0- lycBase,
- 23. Tipos de Basesde Datos Database Types Other Hay muchas BD de Genomas Gene Nucleotide Expression Sequence RNA Sequence Disease La mayoria no son de secuencias Protein Genome Sequence Hay muchas bases de datos especificas (human) Pathways Bases de datos especializadas en Structure enfermedades Genome (non- human)
- 24. • Actualizaciones diarias entre NIH (USA) Entrez • los paises DDBJ, GenBank and EMBL. NCBI •Submissions GenBank •Submissions •Updates •Updates EMBL DDBJ CIB EBI •Submissions •Updates SRS EMBL(Europa) getentry NIG (JAPON)
- 25. Tipos de Basesde Datos Biologicas Primarias (almacenamiento) GenBank/EMBL/DDB UniProt (proteinas) PDB (estructuras) Medline (PubMed) Articulos Secondary (curadas) RefSeq Taxon (taxonomia) SwissProt (proteinas curadas) OMIM (genes-enfermedades)
- 26. Formatos frecuentes desecuencias de ADN y Proteinas Genbank ASN1 FASTA GCG >gi|1345098|gb|U30791.1|PCU30791 TGAATTCTAAATTTTATATTTCTAATTGCATTTTATATTTTTGATAA IG(Intelligenetics) TACTAGATTTATTCCTGGAAACTTAAATTAGTTATTTTAAGTTATG Text GGATGTTGTTTTTCTGCTACATATAACCAAGATACACTTCGTTCC AA
- 27. ¿Cómo averiguar siuna secuencia ya existe en una Base de datos? ¿Cómo averiguar si hay una secuencia similar a la mia en otro genoma? ¿Cómo averiguar cual es la funcion de mi secuencia desconocida?
- 28. La respuesta: Busquedas desimilaridad Por homología (similaridad en la secuencia) Requiere una secuencia para Un Algoritmo para buscar con mi buscar Una base de datos secuencia en la Base de secuencias >Mi_Secuencia_desconocida de datos TGAATTCTAAATTTTATATT donde BUSCAR TCTAATTGCATTTTATATTTT TGATAATACTAGATTTATTC CTGGAAACTTAAATTAGTT ATTTTAAGTTATGGGATGTT GTTTTTCTGCTACATATAAC CAAGATACACTTCGTTCCA A
- 29. BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool) http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Encuentra las regiones de similitud entre secuencias locales. El programa compara secuencias de nucleótidos o proteínas con bases de datos de secuencias y calcula la significancia estadística de concordancias. BLAST puede ser usado para inferir relaciones funcionales y evolutivas entre las secuencias, así como ayudar a identificar a miembros de familias de genes.
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- 31. Distintos Tipos deBLAST Tipo de Base Secuencia Tipo de Programa de datos desconocida Alineamiento BLASTP Proteina Proteina Gapped ADN ADN BLASTN Gapped (Nucleic) (Nucleic) ADN Frame BLASTX Proteina Traducido a Gapped Proteina BD de ADN Frame TBLASTN Traducida a Protein Gapped Proteina BD de ADN Trans. TBLASTX Traducida a Ungapped Nucleic Proteina
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- 35. Regís presentó aHenry Wu, un hombre tranquilo, esbelto, de unos treinta años. El doctor Wu es nuestro genetista jefe. Dejaré que les explique lo que hacemos aquí. Por lo menos lo intentaré, sonrió Wu. La genética es un poco complicada. Pero es probable que ustedes se estén preguntando de donde viene nuestro ADN de dinosaurio. Es algo que me pasó por la cabeza, dijo Grant. A decir verdad, empezó Wu, existen, dos fuentes posibles. Mediante la técnica de anticuerpos de Loy, a veces podemos obtener ADN directamente de huesos de dinosaurio. ¿Con qué rendimiento?, preguntó Grant. Bueno, la mayoría de las proteínas solubles se lixivia durante la fosilización, pero el veinte por ciento de las proteínas es aún recuperable a través de la pulverización de los huesos y del posterior uso del procedimiento de Loy. El mismo doctor Loy lo empleó para obtener proteína de marsupiales australianos extinguidos, así como células sanguíneas de antiguos de restos humanos. La técnica de Loy es tan refinada que puede funcionar con una cantidad tan ínfima como cincuenta nanogramos de material, es decir, cincuenta mil millonésimas de gramo. ¿Y ustedes adaptaron esta técnica aquí? , preguntó Grant.
- 36. Sólo como respaldo.Como podrán imaginar, un rendimiento del veinte por ciento es insuficiente para nuestro trabajo. Necesitamos toda la cadena de ADN de dinosaurio para poder hacer clones. Y lo obtenemos aquí. Sostuvo en alto una de las piedras amarillas de ámbar, la resina fosilizada de savia de árboles prehistóricos. Grant miró a Ellie y, después, a Malcolm. Eso es muy inteligente en verdad , dijo Malcolm, asintiendo con la cabeza. Sigo sin entenderlo , admitió Grant. La savia de árbol , explicó Wu, a menudo fluye sobre los insectos y los atrapa. Entonces, los insectos quedan perfectamente conservados dentro del fósil. Se encuentra toda clase de insectos dentro del ámbar... ..incluyendo insectos picadores que succionaron sangre de animales más grandes. Succionaron la sangre —repitió Grant. Quedó con la boca abierta—: Usted quiere decir «succionaron la sangre de los dinosaurios». Con suerte, sí. Y entonces los insectos se conservan en ámbar... ,Grant sacudió la cabeza, ¡Quién lo hubiera pensado! Podría funcionar. Se lo aseguro, sí que funciona , dijo Wu. Fue hacia uno de los microscopios estereoscópicos, en el cual uno de los técnicos ponía en posición un trozo de ámbar que contenía una mosca bajo los objetivos dobles.
- 37. Sobre la pantalladel monitor observaron cómo el técnico insertaba una aguja larga a través del ámbar, hasta penetrar en el tórax de la mosca prehistórica. Si este insecto tiene células sanguíneas no pertenecientes a él, puede que consigamos extraerlas y obtener ADN, el ADN de un ser extinguido. No lo sabremos con seguridad, claro está, hasta que extraigamos lo que sea que haya ahí dentro, hagamos réplicas y lo sometamos a ensayos. Eso es lo que llevamos haciendo desde hace cinco años. Ha sido un proceso largo y lento, pero que rindió buenos resultados. Tim vio que el doctor Grant mantenía su aire de escepticismo, y Dennis Nedry, el gordo desaliñado, parecía carecer por completo de interés, como si ya supiera todo eso. Pero lo que sí hacía era seguir mirando con impaciencia la sala siguiente. Veo que el señor Nedry descubrió la fase siguiente de nuestro trabajo , dijo Wu, cómo identificamos el ADN que extraemos. Para eso, utilizamos ordenadores potentes. Por unas puertas corredizas pasaron a una sala muy refrigerada. Se oía un fuerte zumbido. Dos torres redondas de un metro ochenta de alto se erguían en el centro de la sala y, a lo largo de las paredes, había hileras de cajas de acero cuya altura llegaba a la cintura de un hombre: Ésta es nuestra lavandería automática de alta tecnología , explicó el doctor Wu. Todas las cajas que hay a lo largo de las paredes son secuenciadores automáticos de genes Himachi-Hood. Los superordenadores «Cray XMP» trabajan a una velocidad muy alta , que son las torres que hay en el centro de la sala. En esencia, ustedes se encuentran en el centro de una fábrica increíblemente poderosa de productos genéticos.
- 38. Intentemos ayudar alDr. Wu a identificar su secuencia >LostWorld DNA gaattccgga agcgagcaag agataagtcc tggcatcaga tacagttgga gataaggacggacgtgtggc agctcccgca gaggattcac tggaagtgca ttacctatcc catgggagccatggagttcg tggcgctggg ggggccggat gcgggctccc ccactccgtt ccctgatgaagccggagcct tcctggggct gggggggggc gagaggacgg aggcgggggg gctgctggcctcctaccccc cctcaggccg cgtgtccctg gtgccgtggg cagacacggg tactttggggaccccccagt gggtgccgcc cgccacccaa atggagcccc cccactacct ggagctgctgcaaccccccc ggggcagccc cccccatccc tcctccgggc ccctactgcc actcagcagcgggcccccac cctgcgaggc ccgtgagtgc gtcatggcca ggaagaactg cggagcgacggcaacgccgc tgtggcgccg ggacggcacc gggcattacc tgtgcaactg ggcctcagcctgcgggctct accaccgcct caacggccag aaccgcccgc tcatccgccc caaaaagcgcctgcgggtga gtaagcgcgc aggcacagtg tgcagccacg agcgtgaaaa ctgccagacatccaccacca ctctgtggcg tcgcagcccc atgggggacc ccgtctgcaa caacattcacgcctgcggcc tctactacaa actgcaccaa gtgaaccgcc ccctcacgat gcgcaaagacggaatccaaa cccgaaaccg caaagtttcc tccaagggta aaaagcggcg ccccccgggggggggaaacc cctccgccac cgcgggaggg ggcgctccta tggggggagg gggggacccctctatgcccc ccccgccgcc ccccccggcc gccgcccccc ctcaaagcga cgctctgtacgctctcggcc ccgtggtcct ttcgggccat tttctgccct ttggaaactc cggagggttttttggggggg gggcgggggg ttacacggcc cccccggggc tgagcccgca gatttaaataataactctga cgtgggcaag tgggccttgc tgagaagaca gtgtaacata ataatttgcacctcggcaat tgcagagggt cgatctccac tttggacaca acagggctac tcggtaggaccagataagca ctttgctccc tggactgaaa aagaaaggat ttatctgttt gcttcttgctgacaaatccc tgtgaaaggt aaaagtcgga cacagcaatc gattatttct cgcctgtgtgaaattactgt gaatattgta aatatatata tatatatata tatatctgta tagaacagcctcggaggcgg catggaccca gcgtagatca tgctggattt gtactgccgg aattc
- 39. ¿Existe una proteínasimilar? Vamos a hacer un Blastx con esta secuencia ADN Frame BLASTx Proteina Traducido a Gapped Proteina
- 40. Selecciona el algoritmoadecuado Copiar y pegar la secuencia en el cuadro Seleccionar la Base de Datos Pincha en Blast
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- 45. 2.Haz un Blastx. Busca proteínas usando la secuencia de nucleótidos Si seguimos el link La secuencia publicada en el libro de Michael Crichton “El mundo perdido” ( The Lost World) la generó Mark Boguski, el experto en biología molecular con el que trabajo Mr. Crichton para escribir la clonación de los dinosaurios. Mark gastó una broma cuando hizo esta secuencia.
- 46. ¿Como conseguimos más informacion? ¿quepodemos deducir? 1- Existe una proteina que se parece mucho a la nuestra, pero no tiene la misma longitud 2- La proteina es un factor de transcripcion de eritrocitos, es decir una proteina que activa la expresion del un gen para la produccion de globulos rojos en pollo (Gallus gallus)
- 47. ¿Y si buscamosen una base de datos de secuencias nucleotidicas? Vamos a hacer un Blastn con esta secuencia para buscar si hay alguna/s secuencias de ADN similares ADN ADN BLASTN Gapped (Nucleic) (Nucleic)
- 48. Selecciona el algoritmoadecuado Copiar y pegar la secuencia en el cuadro Others Seleccionar la Base de Datos Pincha en Blast
- 49. Resultados: ¿como interpetarlos? Gallus gallus GATA binding protein 1 (globin transcription factor 1) Chicken erythroid-specific transcription factor eryf1 mRNA, complete cds Xenopus laevis GATA-binding protein Xenopus laevis (XGATA-2) gene, GATA binding complete cds protein 1 (globin transcription factor 1) (gata1-b), mRNA Nuestra secuencia de Dinosaurio esta compuesta de 3 secuencias actuales
- 50. ¿Que significa loque hemos encontrado? Nuestra secuencia desconocida capturada en el ámbar hace millones de años está compuesta de 3 secuencias actuales de dos especies distintas 1 de Gallus gallus (pollo) 2 de Xenopus laevis (la rana) Podemos concluir que nuestra secuencia es de Dinosaurio
- 51. ¿Qué es Ensembl? •Es un repositorio de genomas completos e información adicional. •Tiene múltiples niveles de acceso con una gran flexibilidad. Da acceso tanto al genoma humano como a otros 50 genomas. Permite la realización de búsquedas de homología Permite descargarse regiones completas del genoma, genes, proteínas, ect.. Permite extraer todas las SNPs en un gen concreto, así como sus consecuencias. http://www.ensembl.org
- 52. ¿Existen otros navegadoresgenómicos? NCBI Map Viewer http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/ UCSC Genome Browser http://genome.ucsc.edu
- 53. ¿Cuál es ladiferencia de estos navegadores comparados con Ensembl? • Ensembl basa su anotación en evidencias experimentales: mRNA y proteínas (más fiable) • Permite realizar análisis comparativos de genes • Permite la integración de datos procedentes de otras bases de datos (DAS) • Permite realizar minería de datos: BioMart (Data-mining tool)
- 54. Genomas disponibles enEnsembl 50 especies la mayoría son vertebrados
- 55. ¿Qué datos podemosencontrar? • ARNs (genes no codificadores de proteínas) • Referencias a bases de datos externas • Genes, proteínas, variaciones de un gen • Otras características del genoma: elementos repetitivos, islas CpG • Secuencias similares y alineamientos de secuencias al genoma completo • Datos de regulación: promotores • Datos de otras fuentes o usuarios(DAS)
- 56. Integración de lainformación Exon Exon Exon Untranslated+Coding Coding Untranslated Genoma cDNAs alineado y proteínas …. demasiada información y poco interpretable
- 57. Ensembl muestra sólotranscritos tipo con evidencia subyacente
- 58. ¿Qué significa unaID en Ensembl? ENSG### Ensembl Gen ID ENST### Ensembl Transcrito ID ENSP### Ensembl Proteína ID ENSE### Ensembl Exon ID Para las demás especies, se añade un código de tres letras que la representa: MUS (Mus musculus) for mouse: ENSMUSG### DAR (Danio rerio) for zebrafish: ENSDARG###, etc.
- 59. ¿Cómo está organizadatoda la información?¿Cómo accedo? Ensembl Views • BioMart „DataMining tool‟ (Website)
- 60. Vamos a pasearpor el genoma… Nuestro ejemplo: el gen de la rodopsina humana (RHO) • Vamos a obtener el resumen de datos para el gen y sus enlaces relaccionados: (Gene Tab) • ¿Cuántas variantes tiene el gen? • Vamos a ver las secuencias genómicas para esas variaciones • Vamos a encontrar secuencias con la misma función en otros organismos • Vamos a obtener los datos para cada transcrito: (Transcript Tab) • ¿Cuál es la secuencia de la proteína que codifica? • ¿Qué informaciones podemos encontrar en otras bases de datos? •¿En qué región del genoma, en qué cromosoma se encuentra el gen?: (Location Tab)
- 61. Vamos a empezar… Ve al navegador y accede a www.ensembl.org
- 62. Vamos a buscarcon el nombre del gen Escribe „gene RHO‟ en la barra de búsqueda como se muestra en la imagen y presiona el botón „Go‟ .
- 63. ¿Cómo encuentro loque busco? Selecciona el primer resultado
- 64. Location Tab o¿dónde está mi gen? Genes que rodean a RHO Variaciones conocidas del gen Rho Todas las visualizaciones se pueden personalizar, añadiendo o retirando información. Para ello usa el enlace Configure a tu izquierda.
- 65. ¿Qué son losenlaces en la ventana de la izquierda? Selecciona Gene Tab ¿Cómo veo la secuencia en el genoma?
- 66. ¿Cómo defino loque quiero ver? Para configurar la página haz click aquí Selecciona: Display variations Determina el número de líneas: Number of lines
- 67. ¿Cómo puedo extraerla secuencia? Después de investigar las ventanas: Location/Gene display, nos gustaría conseguir la secuencia genómica en la que se encuentra el gen RHO. Para ello ve a “Export data option” y haz click en “Next”
- 68. Genómica Comparativa: Alineamientos genómicos Para ver el alineamiento genómico a nivel de nucleótidos Selecciona “12 eutherian mammals ¿Cómo puedo ver los EPO”. EPO se refiere al flujo de alineamientos genómicos programas detrás de los alineamientos que hay de esta region? de genomas completos Los residuos idénticos están marcados
- 69. Tipos de secuenciasHomólogas Secuencias homólogas son secuencias muy parecidas • Ortólogas: Son secuencias muy parecidas que realizan la misma función en distintos organismos. Normalmente comparten un ancestro común y se identifican en los árboles por eventos de especiación. • Parálogas: Cualquier secuencia parecida que proviene de un proceso de duplicación. Normalmente terminan desempeñando otra función.
- 70. Cómo ver secuenciasHomológas en Ensembl: Tree View Haz click en Gene tree (image). Esta imagen te muestra todos los genes parecidos a tu secuencia en el contexto de un árbol filogenético. Este árbol sirve para identificar secuencias ortólogas y parálogas Click en Orthologues para ver las secuencias ortólogas identificadas por el árbol Click en cualquier nodo para extender o reducir el árbol.
- 71. Tabla de secuenciasortólogas ¿Qué es „1 to 1‟? one-to-one ortólogo: En ambas especies sólo hay un ortológo. ¿Qué es „1 to many‟? one-to-many or many-to-many ortólogos: en al menos una de las dos especies hay una duplicación después de la separación de ambas especies (especiación)
- 72. Cómo interpretar losárboles Un cuadrado azul es un proceso de especiación (Orthologos) Un cuadrado rojo es un proceso de duplicación (Paralogos)
- 73. Gene Tab: Informaciónde un gen Vuelve al Gene Tab. Vamos a concentrarnos en el transcrito (mRNA, es el gen sólo con la parte informativa). Selecciona el transcrito más largo de la tabla (ENST00000296271). Esto te llevará al resumen del transcrito Transcript Tab En el menú de la izquierda en Configure puedes seleccionar qué y cómo lo quieres ver.
- 74. Exones de unTranscrito Selecciona Exons en el menú de la izquierda para visualizar las secuencias de los exones. Esta vista te muestra flancos (exones, intrones y las secuencias que flanquean al gen). (verde) UTRs (morado) Intrones (azul) Secuencias codificadoras de proteínas (CDS) Configure para cambiar la vista: (negro) enseñar las secuencias de los intrones enteras, mostrar sólo exones, ect..
- 75. ¿Hay información sobremi secuencia en otras bases de datos biológicas? Aquí podrás ver todas las referencias a bases de datos externas que se conocen sobre tu secuencia. General identifiers
- 76. ¿Cómo es laproteína que codifica m gen? Ensembl proteína Motivos mapeados a la secuencia Haciendo click en Domains & features se muestran todos los motivos que se han encontrado en la proteína.
- 77. Variaciones Genómicas: SNP • Polymorfismo: Es una variación del ADN que está presente en al menos un 1% de la población • El 90% de los polimorfismos son SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Es decir variaciones de un solo nucleótido (símbolo) en el ADN Type Description Consequence non-synonymous SNP SNPs en el ADN altera un Fibrosis cística(CFTR) aa de la proteína Hemofilia (F8) synonymous SNP SNPs en el ADN no altera Pero puede afectar a la la secuencia de la proteína correcta producción del transcrito regulatory SNP SNPs está en una región Puede afectar el nivel de reguladora de la expresión expresión SNPs en otras regiones Útiles como marcadores “No tiene impacto”
- 78. Tabla de VariacionesGenómica Mira la tabla de variaciones para RHO a partir de la Gene Tab
- 79. Imagen de VariacionesGenómica Muestra de una forma gráfica las variaciones sobre la secuencia del Transcrito Selecciona en Configure “Consequence Type” Selecciona sólo Non_Synonimo us SNPs
- 80. Conceptos básicos antesde empezar
- 81. GCCACATGTAGATAATTGAAACTGGATCCTCATCCCTCGCCTTGTACAAAAATCAACTCCAGATGGATCTAA ¿Qué es el ADN? GATTTAAATCTAACACCTGAAACCATAAAAATTCTAGGAGATAACACTGGCAAAGCTATTCTAGACATTGGC TTAGGCAAAGAGTTCGTGACCAAGAACCCAAAAGCAAATGCAACAAAAACAAAAATAAATAGGTGGGACCTG ATTAAACTGAAAAGCCTCTGCACAGCAAAAGAAATAATCAGCAGAGTAAACAGACAACCCACAGAATGAGAG AAAATATTTGCAAACCATGCATCTGATGACAAAGGACTAATATCCAGAATCTACAAGGAACTCAAACAAATC AGCAAGAAAAAAATAACCCCATCAAAAAGTGGGCAAAGGAATGAATAGACAATTCTCAAAATATACAAATGG CCAATAAACATACGAAAAACTGTTCAACATCACTAATTATCAGGGAAATGCAAATTAAAACCACAATGAGAT Es un alfabeto de 4 caracteres GCCACCTTACTCCTGCAAGAATGGCCATAATAAAAAAAAATCAAAAAAGAATAAATGTTGGTGTGAATGTGG TGAAAAGAGAACACTTTGACACTGCTGGTGGGAATGGAAACTAGTACAACCACTGTGGAAAACAGTACCGAG ATTTCTTAAAGAACTACAAGTAGAACTACCATTTGATCCAGCAATCCCACTACTGGGTATCTACCCAGAGGA Este alfabeto de 4 caracteres contiene suficiente información para AAAGAAGTCATTATTTGAAAAAGACACTTGTACATACATGTTTATAGCAGCACAATTTGCAATTGCAAAGAT ATGGAACCAGTCTAAATGCCCATCAACCAACAAATGGATAAAGAAAATATGGTATATATACACCATGGAACA crear organismos complejos, mediante el uso de largas palabras CTACTCAGCCATAAAAAGGAACAAAATAATGGCAACTCACAGATGGAGTTGGAGACCACTATTCTAAGTGAA ATAACTCAGGAATGGAAAACCAAATATTGTATGTTCTCACTTATAAGTGGGAGCTAAGCTATGAGGACAAAA GGCATAAGAATTATACTATGGACTTTGGGGACTCGGGGGAAAGGGTGGGAGGGGGATGAGGGACAAAAGACT Similitud con el código binario ACACATTGGGTGCAGTGTACACTGCTGAGGTGATGGGTGCACCAAAATCTCAGAAATTACCACTAAAGAACT TATCCATGTAACTAAAAACCACCTCTACCCAAATAATTTTGAAATAAAAAATAAAAATATTTTAAAAAGAAC TCTTTAAAATAAATAATGAAAAGCACCAACAGACTTATGAACAGGCAATAGAAAAAATGAGAAATAGAAAGG AATACAAATAAAAGTACAGAAAAAAAATATGGCAAGTTATTCAACCAAACTGGTAATTTGAAATCCAGATTG AAATAATGCAAAAAAAAGGCAATTTCTGGCACCATGGCAGACCAGGTACCTGGATGATCTGTTGCTGAAAAC AACTGAAAATGCTGGTTAAAATATATTAACACATTCTTGAATACAGTCATGGCCAAAGGAAGTCACATGACT AAGCCCACAGTCAAGGAGTGAGAAAGTATTCTCTACCTACCATGAGGCCAGGGCAAGGGTGTGCACTTTTTT TTTTCTTCTGTTCATTGAATACAGTCACTGTGTATTTTACATACTTTCATTTAGTCTTATGACAATCCTATG AAACAAGTACTTTTAAAAAAATTGAGATAACAGTTGCATACCGTGAAATTCATCCATTTAAAGTGAGCAATT CACAGGTGCAGCTAGCTCAGTCAGCAGAGCATAAGACTCTTAAAGTGAACAATTCAGTGCTTTTTAGTATAT TCACAGAGTTGTGCAACCATCACCACTATCTAATTGGTCTTAGTCTGTTTGGGCTGCCATAACAAAATACCA CAAACTGGATAGCTCATAAACAACAGGCATTTATTGCTCACAGTTCTAGAGGCTGGAAGTGCAAGATTAAGA
- 82. ¿Qué es elADN? Fosfato Base nitrogenada • ADN: Deoxyribonucleic Acid (ácido dexosiribonucleíco) • 4 nucleotidos: – Adenosina (A) – Citosina (C) – Guanina (G) – Timina (T) Azúcar Nucleótido
- 83. Un Gen esun segmento de DNA que da lugar a una proteína
- 84. Adenina (A) Citosina (C) Siempre se une a Siempre se une a Timina (T) Guanina (G) A G T A C T G C G T C A T G A C G C Ser Stop Arg Proteína
- 85.
- 86. Esquema de latranscripción
- 87. Código genético Un codóntiene 3 bases Adenina Timina Guanina Citosina 4 * 4 * 4 = 64 combinaciones posibles (codon) Codón de inicio: AUG Codónes de parada o Stop: UAA, UAG, UGA 61 codones codifican el resto de los 20 amino ácidos (AUG también 20 aminoácidos Metionina)
- 88. Organización del genomahumano Distribución no uniforme de genes y repeticiones a lo largo del GH. 5% es codificante 50% es copia única 50% DNA repetitivo
- 89. Organización del genomahumano Cariotipo normal: 46, XX
- 90. Organización del genomahumano
- 91. Ejemplo de organizaciónde una región del GH
- 92. Organización del genomahumano
- 93. Organización del genomahumano Introducción 93
- 94. Mutación Cambios permanentes/heredables producidosdurante la replicación de DNA Probabilidad de mutación en células humanas: 1 de cada 105
- 95. Mecanismos celulares dereparación DURANTE LA REPLICACIÓN: -Roturas de una de las hebras de DNA (DNA polimerasa I/DNA Ligasa) -Inserción de un nucleótido (DNA polimerasa (exonucleasa3’-5’, actividad correctora de errores) POR EXPOSICIÓN A RADIACIONES EXTERNAS: -Formación de dimeros de timina (DNA polimerasa I/endomnucleasa 5’-3’
- 96. Mecanismos de mutación A C T G C T DELECION SUSTITUCION A C G C A C C G C T T INSERCION -T TxC A C T T G C T +T
- 97. Mutación neutra His Lys Tyr His C A C A A G U A U C A C MUTACIÓN C A C A A G U A G C A C His Lys Tyr His
- 98. Mutación sin significado (nonsensemutation) His Lys Tyr His C A C A A G U A U C A C MUTACIÓN His Lys C A C A A G U A A TRIPLETE DE PARADA
- 99. Mutación de significadoerróneo (missense mutation) His Lys Tyr His C A C A A G U A U C A C MUTACION C A C A A G U G U C A C His Lys Cis His
- 100. Métodos de detecciónde mutaciones La detección de mutaciones es esencial para la caracterización molecular, diagnostico, prevención y tratamiento de enfermedades. Los cambios en el DNA son responsables de fenotipos particulares MÉTODO DE DETECCIÓN: - SECUENCIACIÓN DIRECTA - ANÁLISIS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN (RFLP) - SSCP (Single-Strand Conformational Polymorphism) - HA (Heterodúplex Analysis) - CSGE (Conformation Sensitive Gel Electrophoresis)
- 101. Qué son losSNPs? La secuencia nucleotídica de dos personas difiere en un punto determinado de ésta GAGAC Transitiones: pu/pu (A y G) py/py (T y C) (~70%) Transversiones: py/pu GATAC Ocurre muchas veces? Es la variación genética más abundante en los genomas y en especial en el Genoma Humano Como media hablamos de 1 cambio cada 500 ó 1000 pares de bases Actualmente se conocen más 2.25x106 validados
- 102. Qué son losSNPs? Allele frecuency (1%) Frecuencia alélica o frecuencia génica es la proporción que se observa de un alelo específico respecto al conjunto de los que pueden ocupar un locus determinado en la población.
- 103. Qué es unalelo? Alelo es cada una de las formas alternativas que puede tener un gen que se diferencian en su secuencia y que se puede manifestar en modificaciones concretas de la función de ese gen.
- 104. Qué es unlocus/loci? Locus (plural loci) es una posición fija sobre un cromosoma, como la posición de un gen o de un biomarcador (marcador genético). El locus cromosómico de un gen podría ser anotado, por ejemplo, como 22p11.2:
- 105. Haplotipos Combinación dealelos en diferente loci a lo largo de un cromosoma los cuales son transmitidos juntos de una generación a la siguiente CG CG TG CG TG TG C/T G/A CG CG CA TG CG TA TG CA CA TA TG TA CA CA TA TA TA CA haplotipos diplotipos En general, en las diferentes regiones cromosómicas se observan pocos haplotipos Estos pocos haplotipos representan la mayoría de variación existente entre distintas personas de una población
- 106. Qué es unhaplotipo Alelos posibles o = LD Gen + disease Haplotipo de Uno de los posibles haplotipos riesgo
- 107. Qué son losSNPs? • Polimorfismo: coexistencia de variante en la población sin repercusión fenotípica. • Presentes en un porcentaje superior al 1% de la población general. • Lo que hace que todo el mundo sea portador de varios cambios respecto a sus vecinos. • Diferentes tipos: genéticos, cromosómicos, proteínicos. • Ejemplo de polimorfismos: Grupos sanguíneos, Rh, HLA..... • Responsables de la variabilidad humana.
- 108. Tipos de Polimorfismos SNP = single nucleotide polymorphism Cambio simple de una base por otra Pequeñas delecciones e inserciones Large-scale copy-number variation/polymorphism (LCV/CNP): Delecciones e inserciones grandes que llevan a variación en el número de repeticiones de una secuencia Alteraciones estructurales: inversiones, translocaciones y aneuploidías
- 109. Papel de losSNPs en las enfermedades compleja Environmental Common multifactorial complex diseases Cause Independently from genetic input Genetic Disease Mendelian diseases
- 110. Papel de losSNPs Gen A Gen D Gen A Enfermedad monogénica Gen B Gen C Enfermedad compleja Herencia dominante, recesiva o Caso esporádico ligada al X 100 100 30 Riesgo genético poblacional Riesgo genético poblacional 100 30 Riesgo genético en distintas familias Riesgo genético en distintos individuos
- 111. Modelo multilocus interactuandocon factores ambientales Gen principal Genes modificadores Ambiente Gen 1 Gen 2 Gen 3 Gen 4 Amb1 Amb 2 Fenotipo
- 112. Para qué sirvenSNPs? 1. Como variación directamente asociada a fenotipo/enfermedad SNPs causales (con función y efecto fenotípico) Farmacogenética (enzimas con cambios funcionales en proteína o promotor. Influyendo en la actividad o expresión y por tanto en la capacidad de metabolizar) SNPs que afectan la terapia contra leucemias a | La mercaptopurina (MP) se convierte en nucleotido tioguanina mediante (HPRT) (metabolito activo), Otro enzima, la TPMT convierte la MP en (MeMP), el metabolito inactivo. b | La frecuencia en la población de la actividad de TPMT muestra un patrón trimodal. --0.3% (mut/mut) for mutations in TPMT, --10% (wt/mut) for mutations in TPMT, -- 90% (wt/wt) TPMT. c | TPMT genotipo esta correlacionado con el fenotipo.
- 113. Para qué sirvenSNPs? 2. Como marcadores genéticos en estudios de: 2.1. Asociación: Casos vs Controles no relacionados REPRESENTATIVE BREAST REPRESENTATIVE CONTROL CANCER POPULATION POPULATION Clinical information of tumours (histológical grade, tumor grade, ....) Patient age/ diagnostico age Environmental data: (smoke, alcohol, diet, sport...) ........ Ej: 900 cases/900 controls CNIO Human genetics Depart
- 114. Para qué sirvenSNPs? 2. Como marcadores genéticos en estudios de: 2.2 Búsqueda de genes implicados en enfermedades: familias 1 2 Los Haplotipos se realizan para A a a a B b b b confirmar la posición del locus de la C c c c enfermedad. D d d d Seguimiento de los marcadores a traves 3 4 5 6 del pedigree observando los puntos de reconbinación A a a a a a a a B b b b b b b b C c c c c c c c Tradicionalmente realizados con D d d d d d d D microsatélites en enfermedades monogénicas, 7 8 9 10 a a a A A a a a B b b b B b b b Actualemente se pueden realizar con C c c c C c c c SNPs (menos informativos pero mucho D d d d d d d D más abundantes).
- 115. Para qué sirvenSNPs? 2. Como marcadores genéticos en estudios de: 2.3 Genética de poblaciones Otras aplicaciones: Forense: Identificación individuos y/ relaciones de parentesco clasificación de especies/subespecies (plantas y animales)
- 116. Cómo trabajar conlos SNPs? Directamente: SNPs (funcionales) TFS Amino acid change Haplotipos: mirando desequilibrio de ligamiento
- 117. Desequilibrio de ligamiento AltoLD. Bajo LD. Pocos Haplotipos Muchos Haplotipos >% de representación <% de representación LD = 0 LD = 1
- 118. Tag_SNP Genotipar tag_SNPs enun bloque con alto desequilibrio de ligamiento da la misma información que genotipando todos los SNPs comunes presentes. Ventaja: económica y tiempo en obtener resultados
- 119. Eficacia y poder tag SNPs Relative power (%) ~300,000 tag SNPs needed to cover common variation in whole genome in CEU random SNPs Average marker density (per kb)
- 120. THE INTERNATIONAL HAPMAPPROJECT A community resource for disease gene discovery
- 121. Proyecto HapMap: http://www.hapmap.org/index.html • 270 DNAs from different % sequencing among partners populations Canada China • 30 trios from Nigeria 10% 10% (Yoriba) UK USA 24% 31% • 30 trios from CEPH: Japan -African_American 25% -European_American • 45 Han Chinese (Beijing)- chromosomes to be • 45 Japanese (Tokyo) screened 2,4p 3,8p,21 8q,9,18q,22,X, 4q,7,18,Y,12 1,6,10,13,20 5,11,14,15,16,17,19
- 122. Proyecto HapMap • Desarrollotecnológico: plataformas/herramientas análisis • Definir patrones de variación genética a lo largo del genoma humano • Guiar la selección de SNPs eficientemente hacia variantes comunes “tags” • Acceso público de todos los datos (ensayos, genotipos, ld, bloques, tags) via página web. Phase I: 1.3 M markers in 270 people Phase II: +2.8 M markers in 270 people
- 123. Proyecto HapMap Variabilidad Humana (Proyecto Genoma Humano) • A raíz del proyecto Genoma Humano se vio que el 0.1% de nuestro genoma es variable, en gran parte debido a los SNP ó polimorfismos de una sola base. •Los SNP son muy frecuentes (se han descrito alrededor de 8 millones a lo largo del genoma) • Están localizados tanto en intrones como en exones (5- 10 SNPs/gen) • Pueden producir ligeras alteraciones en la proteína que van a ser responsables de nuestra variabilidad.
- 124. Como se detectanlos SNPs? G (wt) LTA Allele1 (A) Allele2 (G) A G (het) TNF Allele2 (A) Allele1 (G) Allele1 (A) Allele2 (C) LST
- 125. Técnicas clásicas degenotipado 1 muestra – 1 SNP Desventajas: muestra, tiempo, dinero. Secuenciación CSGE SSPC DHPLC
- 126. Taqman Permitegenotipar 384 muestras para un único SNP. Ventaja: mayor número de muestras.
- 127. DHPLC Discriminates Heteroduplex fragments from homoduplexes . Appropiated fragment melting t . Specific ACN % according to size and GC content 2a. DHPLC results Het A Het B (1st postion) Hom atg (2nd,3rd pos) Hom tgt Hom tgt Hom tgt Hom atg NME1 promotor fragment
- 128. Highthoughput Illumina SNPlex Sequenom Extensión Amplificación Amplificación Hibridación sondas Minisecuenciación fluorescentes Análisis Espectrómetro 384 muestras/plexes 48 SNPs 384 muestras/plexes de 8 SNPs + Capacidad de genotipado -
- 129. DNA Genómico Captura ensoporte sólido Plataforma Illumina 1536 tipos de Bead Hibridación de oligos Un solo tubo Extensión alelo-específica y Ligación ASOs P1 3’ Etiqueta 5’ P2 P3 5’ LSO PCR con primers Universales P1 P3 P2 Etiqueta Hibridación contra el array Escaneo T/T T/C C/C
- 130. SNPlex 1. Activación de los oligonucleótidos 2. Ligación de los oligonucleótidos 3. Purificación de los oligonucleótidos ligados 4. Amplificación con primers universales 5. Captura del DNA biotinilado 6. Hibridación con sondas ZipChute 7. Elución de las sondas ZipChute 8. Electroforesis capilar para la detección de las sondas ZipChute 9. Análisis de los resultados con GeneMapper ZipCode1 ZipCode2 NNNNNNNNN NNNNNNNNN electroforesis A1A1 A1A2 A2A2
- 131. Sequenom La tecnologíade MassArray (Sequenom) se basa en la detección de los productos de la reacción de discriminación alélica mediante MALDI-TOF. El proceso de genotipado consta de dos reacciones. • Amplificación de los fragmentos de ADN que contienen los SNPs de interés mediante una PCR multiplex. • Reacción de discriminación alélica, a través de una reacción de minisecuenciación que bien terminará en la base polimórfica o bien continuará por la región amplificada de cada SNP dependiendo de la presencia o ausencia de uno de los dos alelos. El uso de cebadores de minisecuenciación con distintas longitudes permite identificar los picos de los productos de cada SNP. Las reacciones tienen lugar en placas de 384 pocillos y los productos de dichas reacciones son transferidos de forma automatizada mediante un robot a la superficie del chip que será leído en el espectrómetro, donde se pueden procesar hasta 10 chips simultáneamente.. Capacidad aproximada: 45.000 genotipos / semana
- 132. NEXT SEQUENCING (NGS) Plataforma Casa comercial Técnica DNA Longitud lectura 454 Roche Síntesis Emulsión PCR 250-400pb SOLID Applied Ligación Emulsión PCR 50pb Biosystem Helicoscope Helicos Síntesis No 25-25pb amplificación GenomeAnalyzer Illumina Síntesis Bridge PCR 32-40 (100)pb Plataforma Capacidad Precio Error Errores 454 300 Mb/día 60$/Mb <1% Si hay muchas bases iguales no sabe cuantas SOLID 600 Mb/día 1$/Mb <0,1% Sustituciones Lee todo 2 veces Lee en los 2 sentidos Helicoscope 1200Mb/día 1$/Mb Alto 4% NC 90Gb GenomeAnalyzer 400 Mb/día 2$/Mb 1%/Mb Sustituciones Lee en los 2 sentidos
- 133. NEXT SEQUENCING (NGS) Plataforma Casa comercial Ventajas/Inconve Ventajas/Inconveni nientes entes 454 Roche SOLID Applied Biosystem Si diferencia SNPs Lee 2 veces Lee en los 2 sentidos Helicoscope Helicos DNA directamente GenomeAnalyzer Illumina No diferencia SNPs Lee en los 2 sentidos Polomator, NanoPore, Visigen, Nabsys, Bionanometre, ZSGenetic
- 134. Herramientas para la búsqueday selección adecuada de SNPs
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- 136. Herramientas SNPs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=sn p http://genome.ucsc.edu/ http://www.hapmap.org/index.html.en http://pupasnp.bioinfo.ochoa.fib.e s/ http://pupasview.bioinfo.ochoa.fib.e s/ http://pga.mbt.washington.edu http://snpeffect.vib.b e/ http://bioinformatica.cegen.upf.es/public/principal/index.p hp
- 137. Herramientas SNPs NCBI dbSNP Entrez System http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov
- 138. dbSNPs 1998 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/
- 139. dbSNPs Contiene distintasfuentes de variación génica: (1) SNPs (2) short deletion and insertion polymorphisms (indels/DIPs), (3) microsatellite markers or short tandem repeats (STRs) (4) multinucleotide polymorphisms (MNPs) (5) named variants ss o submitted SNP : Todo centro privado o público puede enviar información acerca de SNP (frecuencia, población,...) en concreto y para eso a cada centro se le asigna un código. Varios ss pueden hacer referencia a un único SNP y por tanto la información general relativa a éste se guarda en un rs o reference SNP.
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- 151. Ontologías Secuenciación degenomas Enormes cantidades de información biológica Necesidad de extraer conocimiento de estos datos Identificar funciones de genes Papel fundamental de las Bio-ontologias para integración automática de conocimiento. 1 5 1
- 152. Motivación Resultados de losmétodos estadísticos y algoritmos de aprendizaje automático (clustering, clasificación): Largas listas de genes PROBLEMA: dar interpretación biológica a estos conjuntos de genes (asignarles una función/rol biológico) SOLUCIÓN: Utilizar las anotaciones de bases de datos y recursos bioinformáticos disponibles
- 153. Anotación funcional Para ayudara la interpretación biológica de grandes listas de genes: ◦ Consultar bases de datos de anotaciones como GO, KEGG, FatiGo, PANTHER, DAVID, IPA ◦ Poner genes en contexto a partir de información extraída de la literatura científica ◦ Identificar Pathways y Procesos enriquecidos ◦ Visualizar la red de interacciones y editarla. ◦ Estudiar si hay clases funcionales enriquecidas entre los genes seleccionados ◦ Agrupar los genes por su similitud funcional
- 154. ¿Qué es GO? GENE ONTOLOGY (GO) http://www.geneontology.org/ Ontología: un vocabulario estructurado y riguroso Función: describir los roles de los genes y sus productos. Utiliza: 3 ontologías independientes: Biological process, molecular function y cellular component. Los términos (nodos) de la ontología tienen relaciones entre sí (es-un, es-parte-de) y forman un Grafo Dirigido Acíclico (DAG).
- 155. Genes y términosGO Términos más generales cuanto más cerca de la raiz Los genes se anotan en el nivel más específico posible, pero comparten los atributos de todos los nodos ancestros.
- 156. Redes genéticas Poner encontexto nuestras listas de genes PANTHER FATIGO DAVID
- 157.
- 158.
- 159. Database for Annotation,Visualization andIntegrated Discovery (DAVID)
- 160. Protein ANalysis THroughEvolutionary Relationships (PANTHER)
- 161.
- 162. Caso práctico: estudiode arrays de Cancer de Recto
- 169. IL1 signalling Accumulative evidencesuggests that IL-1 plays critical roles in the development of malignant lesions. The most compelling evidence was generated in IL-1 knockout (KO) mouse models. Voronov et al. have demonstrated the critical roles of IL-1 in tumor invasiveness and angiogenesis. Mice solely deficient in IL-1 or IL-1 exhibit dramatically impaired tumor development and blood vessel growth.
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- 173. Caso práctico deontologías PANTHER http://www.pantherdb.org/
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