Este documento describe las técnicas de extracción de ácidos nucleicos como el ADN y el ARN. Brevemente explica que el ADN y el ARN son macromoléculas formadas por nucleótidos que contienen la información genética de los seres vivos. Luego resume los principales métodos de extracción como fenol-cloroformo, Chelex, papel FTA, columnas de sílica y salting-out, destacando sus ventajas y desventajas. Finalmente, brinda detalles sobre las muestras, factores que a

1. TÉCNICAS DE
EXTRACCIÓN DE
ÁCIDOS NUCLEICOS
DRA. MARISEL DE LUCCA

2. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, son
MACROMOLÉCULAS de elevado peso molecular
El genoma humano
posee ~ 3,3 x 109 pares
de bases.

3. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, son
MACROMOLÉCULAS de elevado peso molecular
El genoma humano
posee ~ 3,3 x 109 pares
de bases.
DNA es un polímero lineal formado por 4
monómeros de nucleótidos (ATP, GTP, CTP,
TTP), enlazados covalentemente.
Todas las células de un organismo contienen igual
contenido de ADN (6pg) excepto los gametos.

4. Se encuentran en todos los seres vivos
Estas biomoléculas están formadas:
•Carbono
•Hidrógeno
•Oxígeno
•Nitrógeno
•Fósforo
Poseen carácter ácido

5. ELDNACOMO ALMACENDE INFORMACIÓN
- El ADN, es el material genético que permite la transmisión de
la información contenida en los genes de generación en
generación. Esta presente en casi todos los seres vivos.
- Contiene toda la información necesaria para construir y
sostener el organismo en que reside (genes y genoma).
- Así como, la información para la producción de proteínas
(transcripción y traducción).
- Se autoduplica (replicación del ADN) para asegurar la
transmisión de la información a las células hijas durante la
división celular.

6. Enlace fosfodiester
2-desoxi-D-ribosa
PENTOSA + BASE NITROGENADA
ÁCIDO FOSFÓRICO + NUCLEÓSIDO
NUCLEOTIDO
2- DESOXIRIBOSA
BASE NITROGENADA
Enlace N-
glucosídico
ÁCIDO FOSFÓRICO
PENTOSA + BASE NITROGENADA
ÁCIDO FOSFÓRICO + NUCLEÓSIDO
NUCLEÓTIDO
Enlace éster
NUCLEOTIDOS

7. pH:7
ADNARN
NUCLEÓTIDOS:BasesNitrogenadas

8. Las propiedades de los nucleótidos afectan la estructura
tridimensional de los ácidos nucleicos
Absorbancia
a 260 nm
- Bases débiles
- Poco o nada solubles en agua
- Son moléculas planas
- Absorben luz UV a 250-280nm, lo que permite su identificación y cálculo de
su concentración: 258nm ARN, 260nm ADN. Absorbancia=1 → 50µg/ml de
ADN → 40µg/ml de ARN
PROPIEDADESDELOSNUCLEÓTIDOS

9. El azúcar en el caso del ADN es la 2-
desoxirribosa y en el caso del ARN es la D-ribosa
NUCLEÓTIDOS:Azúcar

10. Cada nucleótido puede contener 1 (monofosfato:
AMP), 2 (difosfato: ADP) o 3 (trifosfato: ATP) grupos de
ácido fosfórico.
Los monómeros constituyentes de los ácidos nucleicos
están en forma de nucleósidos monofosfato.
NUCLEÓTIDOS:Ácidofosfórico

11. ADN ARN
Insoluble en soluciones
diluidas de NaCl
Soluble en soluciones
diluidas de NaCl
Solubles en soluciones
concentradas de NaCl
Insoluble en alcoholes
Puede ser disociado de la proteína por
tratamiento con un detergente o un fenol
PROPIEDADESDELADNYARN

12. ESTRUCTURA
DELOS
ÁCIDOS
NUCLEICOS

13. Polímeros de
Nucleótidos:
DNA
Cargados
negativamente
El enlace
fosfodiester se
forma entre el OH
del Ac fosfórico
(C5´) de un
nucleótido y el OH
del carbono #3 del
azúcar de otro
nucleótido + H2O
Sentido 5´→→→→3´
PROPIEDADESDELADN

14. -Las cadenas de ARN son mucho mas cortas ya que son copias de determinadas zonas
(gen) de una cadena de ADN.
-El ADN posee la misma estructura en todas las células del organismo, mientras el ARN
puede presentar principalmente 3 estructuras: ARNm (forma extendida), ARNt y ARNr
(forma plegada).
El ARN está constituido por una cadena de ribonucleótidos unido por
enlaces fosfodiester.
Diferencias entre el ADN y el ARN
• Regulación
ESTRUCTURA DEL ARN
Hélice
Hélice

15. Muestras para extracción de ADN
• Sangre, sangre en papel.
• Semen, manchas.
• Saliva, hisopos.
• Cabello.
• Hueso.
• Diente.
• Tejido.
- Es importante conocer las condiciones para la remisión
adecuada de las muestras.
- El ADN es muy estable y sólo se requiere mantener las
muestras congeladas antes de su extracción.

16. Factores que afectan el rendimiento,
la calidad y pureza del ADN
• Cantidad de material de partida: # de copias del ADN
target y cantidad de tejido.
• Condiciones en las que se encuentra el material de inicio
(fresco, congelado, fijado).
• Contaminantes e interferentes en el material biológico.

17. Precauciones para evitar contaminación
• Es necesario limpiar las áreas de trabajo con soluciones
como el HCL 10%, NaOH 0.5N y/o etanol 70%.
• También hay que utilizar guantes para protección
personal y para evitar contaminar las muestras.
• Trabajar con materiales y soluciones estériles.
• Se recomienda trabajar en una campana de flujo laminar
y someter el material a LUV 5 - 10 min para degradar
cualquier ácido nucleico presente.

18. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN
• Fenol – cloroformo
• CHELEX
• Papel FTA
• Columnas de sílica
• Salting – Out

19. FENOL - CLOROFORMO
• Técnica Orgánica.
• ADN de muy buena calidad (alto peso molecular) y cantidad
(fase acuosa)
• Péptidos y proteínas son extraídas en la fase orgánica (fenol),
después se realiza digestión con proteinasa K.
• El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado.
DESVENTAJAS:
• Reactivos altamente tóxicos.
• Consume mucho tiempo
• Pérdidas significativas de ADN, sobretodo si está degradado.
• Múltiples transferencias de tubos, riesgo de contaminación

20. FENOL - CLOROFORMO

21. CHELEX
• Técnica inorgánica.
• Es un copolímero quelante de iones metálicos como el Mg2+ inactiva
las DNasas y otras enzimas que pueden interferir en la PCR y otras
aplicaciones basadas en enzimas (ligación, etc).
• Elimina eficientemente los productos de la lisis celular (fuentes de
ADN: sangre total, bacterias y cultivo de células).
• Los reactivos no son tóxicos y no se pierde ADN.
• Pueden utilizarse en muestras con ↑[sales].
• Ventaja: económica, sencilla y rápida (un simple paso de ebullición en
presencia de la matriz, se utiliza el SN directo en la PCR).
DESVENTAJAS:
• ADN aislado es de cadena sencilla (desnaturalizado), utilizado en PCR
pero no en RFLPs.

22. CHELEX

23. PAPEL FTA
• Papel almacenaje a base de celulosa.
• Estable a RT por años.
• Utilizada para muestras de sangre o saliva de víctimas o
sospechosos.
• Cuantificación no es necesaria: cantidad de muestra
consistente
• Posible automatización.

24. • Rompe células y membranas de organelos.
-Físicamente Atrapa Acidos Nucleicos (ADN & ARN)
• Preserva y Proteje Acidos Nucleicos
-Previene Daño por radicales libres/UV
-Previene Daño Enzimático (nucleasas)
-Inhibe crecimiento de hongos y bacterias
• Provee Seguridad al Usuario
-Inactiva Potenciales Virus Peligrosos
• Se añade directamente el papel lavado (para remover HEME y otros
inhibidores) a la mezcla de PCR
PAPEL FTA

25. ORGÁNICA Papel FTACHELEX
Mancha
de sangre
ROTO
LAVAR Múltiples veces con
buffer de extracción
PREPARAR PCR
Reactivos de
PCR
SDS, DTT, EDTA y
proteinase K
ENCUBAR (56 oC)
Phenol,
chloroform,
isoamyl alcohol
CUANTIFICAR ADN
Aplicar sangre al
papel y dejar que se
sequeMancha
de sangre
VORTEX
(NO CUANTIFICACIÓN)
Agua
ENCUBAR (ambiente)
5%
Chelex
ENCUBAR (100 oC)
REMOVER sobrenadante
ENCUBAR (56 oC)
CUANTIFICAR ADN
PREPARAR PCR
PREPARAR PCR
Centrifugar
Centrifugar
Centrifugar
Centrifugar
REMOVER sobrenadanteTRANSFER aqueous (upper) phase to new
tube
CONCENTRAR muestra
(Centricon/Microcon-100 or ethanol
precipitation)
Centrifugar
TE buffer
Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

26. Cromatografía de adsorción
(membranas de sílica gel)
Descubierta en 1979 por Bert Vogelstein, demostró que el ADN
se unía al polvo de vidrio en presencia de yoduro sódico.
Esta sal caotrópica:
• Desestabiliza las moléculas de agua.
• Desnaturaliza las proteínas.
• ↑ la solubilidad de sustancias apolares.
• Destruye las interacciones hidrofóbicas.
• Lisa las células e inactiva las nucleasas.
Esta metodología se basa en la adsorción y desorción de los
ácidos nucleicos a membranas de sílice, en presencia de sales
caotrópicas.

27. • Bajo condiciones nativas, los Ac. nucleicos están recubiertos de una
capa de agua que mantienen su solubilidad en soluciones acuosas.
• Con la adición de iones caotrópicos, se destruye esta capa hidratante,
creando un entorno hidrofóbico, lo cual permite que el ADN se una a la
membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas y otros
contaminantes no se unen y son eliminados durante los pasos de
lavado.
• Los ácidos nucleicos se eluyen de la membrana utilizando tampones de
elución con ↓ [sales] (ligeramente alcalinos) o agua, que permiten
recuperar la capa hidratante liberándolos de la membrana, sin afectar
los Ac. nucleicos.
Cromatografía de adsorción
(membranas de sílica gel)

28. Cromatografía de adsorción
(membranas de sílica gel)
Con este rápido proceso de purificación, se obtiene ácidos nucleicos altamente
purificados para ser usados en procesos posteriores como PCR, RT-PCR, qPCR,
secuenciación, blotting, clonaje, etc.
Se obtienen 3 – 10ug a partir de 200ul de sangre total.

29. SALTING-OUT
• Técnica inorgánica.
• Procedimiento que consiste en la adición de una solución
salina saturada, que precipita las proteínas y deja el ADN en
solución.
• Utiliza reactivos de baja toxicidad.
• Permite visualizar el ADN como una madeja.
Desventajas: Requiere una mayor cantidad de muestra

30. Este es uno de los métodos de extracción de ADN mas
utilizados por su fácil implementación.
Los pasos generales:
• Lisis Celular y extracción
• Precipitación
• Resuspensión
SALTING-OUT

31. LISIS DE CÉLULAS
• Se rompen las membranas plasmáticas, por medio de
sales, liberando al medio su contenido (ADN), (Buffer de
lisis I, elimina glóbulos rojos, NonidetP40, lisis de células
y Buffer de lisis II, rompe glóbulos blancos y sus núcleos).
• Degradación de la fracción proteica asociada al ADN,
mediante la adición de una proteasa (SDS, detergente
que se utiliza para eliminar membranas y desnaturalizar
proteínas), haciendo que esta fracción precipite con
ayuda de sales (NaCl solución saturada, solubiliza el
ADN).

32. PRECIPITACIÓN DEL ADN
• Etanol frío, provoca la precipitación del ADN por
deshidratación. El alcohol logra eliminar las sales
añadidas.
• Lavado con alcohol frío al 70%, elimina las proteínas y
sales añadidas.

33. RESUSPENSIÓN
• El botón o madeja de ADN se resuspende en buffer TE
(Tris-HCL y EDTA) para protegerlo de la degradación y
estabilizarlo.
Se obtienen 130 – 160ug a partir de 5ml de sangre total.

34. ARN
• El ácido ribonucleico esta formado por una cadena de
ribonucleótidos. Está presente en células procariotas y
eucariotas, es el único material genético de ciertos virus. El
ARNm es lineal y de hebra sencilla, pero el genoma de algunos
virus es de doble hebra.
• El ADN contiene la información que determina la estructura
del ARN, sin embargo, el ARNm es la molécula encargada de
dirigir la síntesis de proteínas necesarias para el desarrollo y
actividades de la célula.

35. Muestras para extracción de ARN
• Células y tejidos de animales y plantas.
• Sangre con EDTA almacenada a 4ºC
• Bacterias.
• Levaduras.
• Muestras líquidas.
- Es importante conocer las condiciones para la remisión adecuada de
las muestras. Procesar la muestra rápidamente, mantenerla todo el
tiempo sobre hielo.
- El ARN es muy lábil, una vez colectada la muestra es necesario
agregarle una solución estabilizante lo antes posible (mezcla de
anticuerpos específicos o inhibidores para ribonucleasas y/o
compuestos que neutralizan a los grupos 2’-OH), ya que los cambios
en el patrón de expresión de los genes debido a la degradación del
ARN o a inducciones en la transcripción ocurren inmediatamente.

36. PRECAUCIONESEN LA EXTRACCIÓNDELARN
• El ARN es una molécula muy frágil, puede romperse por acción de los grupos
2’-OH (altamente reactivos) adyacentes al esqueleto de ribosa-fosfato.
• Evitar la contaminación con RNAsas, enzimas muy estables que no requieren
cofactores para su función. Se deben tratar las soluciones y los materiales con
Dietil-piro carbonato (DEPC), el cual inactiva las ribonucleasas por
modificación covalente o soluciones como RNAasa AWAY para remover
RNAasa de la superficie de trabajo.
• Se debe trabajar con material estéril o desechable, ya que las ARNasas no son
inactivadas en su totalidad en el autoclave.
• El material de vidrio debe lavarse con una solución NaOH 0.5N , enjuagarse 3
veces con H2Obd y autoclavar por 2h.
• El material de plástico debe limpiarse con Etanol 100% y autoclavar por 45
min.
• Las microesferas de vidrio utilizadas en la extracción, para incrementar la lisis
celular por acción física, deben someterse a combustión x 12 h a 450º C y
autoclavar por 45 min.
• Los reactivos deben mantenerse en alícuotas en volúmenes necesarios para
cada etapa del proceso y si es posible autoclavarlos 2 veces.

37. METODOS DE EXTRACCIÓN DE ARN
La mayoría de protocolos para extracción de ARN están basados en el
método descrito por Chomezynski y Sacchi (1987), el cual se emplea
fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina.
Etapas de procedimiento:
• Homogenización de la muestra con el (los) reactivo (s) que
contengan la solución fenol-isotiocianato (ej. Trizol: conserva la
integridad del ARN, rompe las células y disuelve sus componentes).
• Adición de cloroformo separa la solución en fase acuosa (ARN) y
orgánica.
• Precipitación del ARN por tratamiento de la fase acuosa con
isopropanol.
• Almacenaje: sobre hielo para uso inmediato y a -80°C en etanol para
almacenaje prolongado.

38. Desarrollado por Chomczynski y Sacchi (1987).
• Tiocianato de guanidina: ácido muy fuerte, con un alto poder
desnaturalizante.
• Fenol acidificado: provoca que el ADN se acumule en la
interfase entre la fase acuosa y el fenol.
• ARN: se acumula en la fase acuosa.
• Sarcosyl: detergente potente que ayuda a la lisis celular, pero
no reemplaza la ruptura física de las células que se logra con
micro esferas de vidrio agitadas con un vórtex o de un
homogenizador celular.
• Es importante tratar las muestras con ADNasas libres de
ARNasas.
GIPS (Ac. Tiosanatodeguanidina,fenol,sarcosyl)

39. Cromatografía de adsorción
(membranas de sílica gel)
Esta metodología se basa en la adsorción y desorción de los
ácidos nucleicos a membranas de sílice, en presencia de sales
caotrópicas.
• Las muestras son lisadas y homogenizadas en presencia de
tiocianato de guanidina, sal caotrópica capaz de proteger al
ARN de las RNAsas.
• Se añade Etanol a la mezcla y se coloca en la columna de
sílica, la cual une ARN.
• Cualquier impureza es removida en los lavados posteriores.
• El ARN se eluye con H2O libre de RNAsas o Buffer Tris pH 7,6.

40. Cromatografía de adsorción
(membranas de sílica gel)
Con este rápido proceso de purificación, se obtiene ARN disponibles para muchas
aplicaciones, si se necesita libre de DNA se puede tratar con DNAasas durante la
purificación.
Se obtienen 15 – 25ug a partir de 106 células animales en cultivo.
Lisis y
homogenizado de
la muestra con
buffer de lisis y
βmercaptoetanol
Etanol y
mezclar
Fijación
del ARN a
la muestra
Lavado
del ARN
Elución
del ARN
RT-PCR, qRT-PCR,
Northern Blot,
Amplificación de
ARN para
microarrays,
librería de ADNc

41. CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
• La cantidad y calidad del ADN o ARN se puede evaluar mediante
Espectrofotometría, este método de análisis óptico permite identificar
compuestos por su espectro de absorción y conocer la concentración de un
material o sustancia.
• Ventajas: rápido, versátil y fácil de usar.
• La espectrofotometría se basa en que la cantidad de luz absorbida por un
medio es proporcional a la concentración del soluto presente a una
longitud de onda específica.
• Concentración de ADN o ARN puede ser determinada midiendo la
absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro nanodrop en 1ul de
muestra.
• El grado de pureza se estima mediante las relaciones 260/280 y 260/230. A
280nm absorben las proteínas, fenoles u otras sustancias y 230nm el EDTA,
carbohidratos o fenol (TRIZOL), asimismo la Guanidina HCL

42. • Espectrometría:
Absorbancia a 260nm: 1DO = 50ug/ml ADNdb
1DO = 40ug/ml ARNbs
1DO = 20-33ug/ml Primer
Pureza: DO260/DO280 = 1,8 ADN y 2,0 ARN
DO260/DO230 = 2,0 - 2,2 ADN/ARN
• Fluorescencia con BrEt: permite medir la cantidad de ADN, ya
que esta es proporcional a la fluorescencia. Se hacen
diluciones del ADN desconocido en presencia de 2ug/ml de
BrEt y se compara con diluciones de un ADN de
concentración conocida, cargados en un gel de agarosa.
CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

43. FIN