Medición de hormona

1. Recomendaciones para la Medición de
Hormonas
Gladys Laverde de Arbeláez
Directora Científica
Laboratorio de Investigación Hormonal
Miembro de ACEP - ACE
I REUNIÓN NACIONAL ANUAL DEL Programa para la Evaluación Directa
del Desempeño en Química Clínica y Hematología
Septiembre 2 /2016

2. Inmunoanálisis
Laboratorio Endocrinología
Objetivos
 Introducción
 Definiciones Inmunoensayo – Marcadores
Conceptos básicos
 Ventajas IE
 Reseña histórica
 Evolución técnicas IE
 Clasificación
 Métodos
 Validación de métodos
 Control de calidad
 Recomendaciones

3. Introducción
• Es necesario el respaldo de un
laboratorio de alta calidad para lograr
un diagnóstico preciso, un manejo
efectivo y a un costo razonable de los
problemas tiroideos.
• En la presencia de una masa tiroidea
de crecimiento rápido, las pruebas de
laboratorio simplemente confirman la
sospecha clínica.
• Los síntomas son tan sutiles que la
patología sólo se puede detectar
mediante una evaluación bioquímica o
citopatológica.
•

4. DETERMINACIONES HORMONALES
• Estructura
• Patrón de secreción,
(interferencias otras patologías).
• Diversidad de metodologías
• Diferencia en valores de
referencia

5. INMUNOENSAYOS
Definición:
• Conjunto de técnicas analíticas que usan
anticuerpos para la determinación selectiva de
ciertos componentes de interés presentes en
muestras biológicas.
• Ensayos altamente selectivos, sensibles de
bajos límites de detección.
• Los IE constituyen los métodos de elección para
múltiples patologías endocrinas.

6. INMUNOENSAYO
• Unión competitiva y especifica de un Ag presente en
la muestra del paciente, estándares o controles y un
Ag* marcado, compitiendo por los sitios de unión
con un Ac especifico, posteriormente una etapa de
incubación y separación de las fracciones libres y
ligadas
Antígeno Anticuerpo

7. MARCADORES
Definición:
Sustancia conocida e identificable que
puede ser medida en el curso de un
procedimiento que implique una reacción
biológica o inmunoquímica.

8. EVOLUCION- TECNOLOGIAS DE
INMUNOENSAYO
RIA: La base.
 Buena sensibilidad
 Largos tiempos para la determinación
 Problemas por la radiación
 Imposibilidad de automatizar

9. RADIOINMUNOANALISIS (RIA)
El antigeno se marca
con radioisótopos
INMUNORRADIOMETRIA (IRMA)
El anticuerpo se
marca con
radioisótopos
I125
I125

10. Reseña histórica
• En 1928, Abrech descubrió las propiedades del luminol un componente
que al oxidarse por medio de peróxido de hidrógeno emite luz como
fotones individuales
• RIA: 1960 Rosalyn Yalow y Solomon Berson cuantificación de Insulina.
• El primer ensayo de quimioluminiscencia fue descrito en 1976 con un
reporte de Schroeder et. al.; reportaron el desarrollo de un ensayo
quimioluminiscente, este ensayo utilizó como indicador el isoluminol
• ELISA: 1980´S
• FIA: 1980´S FPIA. Primer método semiautomatízado

11. Evolución en técnicas de Inmunoensayo
RIA
Radioimmunoassay
EIA
Enzyme Immunoassay
FIA / LIA
Fluorescence /
Luminescence
Immunoassay
ECLIA
Electro-
chemiluminescence
Immunoassay

12. CLASIFICACION INMUNOANALISIS
TECNICA MARCADOR - SUSTRATO DETECTOR
RIA  Ag – I-125 CONTADOR DE RAYOS
GAMA
IRMA AC – I-125 CONTADOR DE RAYOS
GAMA
ELISA
Ag o AC- ENZIMAS
FOSFATASA ALCALINA -
PEROXIDASA DE RABANO
LECTOR DE MICROELISA

13. CLASIFICACION INMUNOANALISIS
TECNICA MARCADOR - SUSTRATO DETECTOR
Fluroinmunoanálisis
IFD
IFI
FIA
MEIA
FPIA
 Ag – Fluoresceina
 AC – Fluoresceina
 Ag o Ac – Europio
 Ac – FAL
⇨ 4 metil umbeliferil fosfato
Ag - fluoresceina
Microscopio F
Microscopio F
Fluorómetro
Lámpara de Mercurio
Lámpara halógena de
tungsteno
(luz – polarizada)
Luminoinmunoanálisis
LIA
Ag o AC Luminol
Isoluminol
Esterés de acridino
Luminómetro
Quimioluminiscencia
QLIA
Ag o Ac – FAL
⇨ Dioxetano - P
Luminómetro
ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA
EQLIA
Rutenio,Osmio,Renio
Microparticulas
magneticas
Analizador
inmunoensayos
ECL

14. INMUNOENSAYOS
b Homogéneos
b Heterogéneos

15. INMUNOENSAYO HOMOGENEO
fase
sólida
Ac
Ag
otras fracciones
No hay separación entre la fracción libre
y la fracción unida

16. Ensayo Heterogéneo
fase
sólida
Ac
Ag
otras
fracciones
otras
fracciones
b LAVADO
b CENTRIFUGACION VERTICAL
El proceso de separación
implica remover
sustancias que puedan
generar interferencia en la
reacción
ESPECIFICIDAD

17. Técnicas de Separación
 Método del doble anticuerpo
 Tubo o pozo recubierto
 Fase sólida
 Adsorción
 Precipitante
 Separación por columna

18. ELISA
Ac anti-TSH
Conjugado Ac
ANTI TSH
ENZIMAS
Sustrato
fluorigénico
cromogénico
FLUORESCENCIA
+
+
Ag
(control,
muestra)
Ac-Ag-Ac
MARCADO
INCUBACION
LAVADO
+
INCUBACION
LAVADO
SOLUCION STOP O
INTENSIFICADORA
*Marcaje mas estable
*Rangos amplios de medida
*Automatización

19. Qué es Quimioluminiscencia?
• Es la generación de radiación
electromagnética en forma de luz como
liberación de energía a partir de una
reacción química.
• La luz puede ser emitida en la región
infrarroja, visible o ultravioleta.
•

20. Principio de la
prueba
B B
Pruebas en Sistemas IMMULITE
anti-IgG Humanos/
+ Fosfatasa Alcalina
Luminescencia
+
Anticuerpo Monoclonal
Anti TSH
ciclo de incubación de
30 minutos
LAVADO
SUBSTRATO
TSH
Fosfatasa alcalina ( Emisión de luz prolongada )
Mayor sensibilidad
Centrifugación
sobre el eje vertical

21.  Primera generación: 1 - 2 uIU/mL
 Segunda generación: 0.1 - 0.2 uIU/mL
 Tercera generación: 0.01- 0.02 uIU/mL
PSA 1ra generacion detectan 0.1 -0.3 ng/mL.
PSA 3ra generación detecta 0.01 ng/mL.
Sensibilidad de las Pruebas

22. Ensayos deTSH

23. Características de un analizador
automatizado de inmunoensayo
• Acceso continuo al azar
• Fácil operación
• Capacidad de procesar urgencias
• Curvas standard estables
• Alto número de pruebas por hora
• Fácil sistema de eliminación de desechos
• Capacidad para comunicación con una
interfase bidireccional

24. ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA (ECL)
 Reactivos altamente
estables
 Rápidos tiempos de
reacción
 Alta sensibilidad
 Amplio rango de medida
 Gran variedad de
analitos a determinar
 No utiliza enzimas
 Marcaje no isotópico
r

25. EVOLUCION- TECNOLOGIAS DE
INMUNOENSAYO
ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA (ECL)
Definición:
 Proceso en el cual se generan especies
altamente reactivas a partir de precursores
estables, en la superficie de un electrodo
(CLIA inducida por un proceso eléctrico)
r

26. Electroquimioluminiscencia

27. CARACTERISTICAS DEL MARCADOR
RUTENIO
 Quelato metálico estable, soluble en agua
 Bajo peso molecular
 Fácil acople con proteinas
 Alta estabilidad en reactivo líquido
r

28. VENTAJAS DE LAS MICROPARTICULAS
MAGNETICAS
 Revestidas con estreptavidina
 Enlace covalente muy fuerte (baja pérdida de
inmurreactividad)
 Alta estabilidad y reproducibilidad lote a lote de
reactivos.
r

29. SISTEMA ELECSYS
Características.
 Posibilidad de urgencias
 Sensibilidad incrementada
-TSH: 0.005 uIU/ml
-PSA: 0.005 ng/ml
 Linearidad e la HCG : 10.000 mIU/ml
r

30. QUE ES LO NORMAL?
 La secreción de T4  por TSH.
 TSH en hipófisis  por hormonas tiroideas, retroalimentación
negativa sensible que mantiene los niveles de T4 libre en
r.normal estrecho.
 TSH  hipotálamo TRH.
 Diagnóstico enfermedades tiroideas se basa:
Hallazgos clínicos.
Palpación de la tiroides.
Mediciones Bioquímicas: TSH,T4L- T3L-Tg-Ac.tiroideos
Imágenes.

31. Causas de discordancia entre T4L y TSH
en ausencia de enfermedad grave asociada

32. Causas de discordancia entre T4L y TSH
en ausencia de enfermedad grave asociada
Factores iatrogénicos como la administración de medicamentos tiroideos y no tiroideos
(por ejemplo: glucocorticoides, betabloqueantes), autoanticuerpos anti-hormonas
tiroideas, anti-Tg, y anticuerpos heterófilos (HAMA) puede afectar la exactitud del
diagnóstico al conducir a una interpretación errónea del resultado.

33. TSH
T4 Libre T3 Total-L
Tamización
Hipotiroidismo Hipertiroidismo
Pruebas Diagnóstico y Seguimiento
T4 total
Ac
TPO - Tg
AntiTSHr

34. Hormona Estimulante de la tiroides TSH
Prueba ideal para diagnóstico de enfermedad tiroidea:
 Alta sensibilidad diagnóstica.
 No está afectada por proteínas séricas
 El T4 Libre se normaliza mas rápidamente que la TSH
en pacientes sometidos a tratamiento.

35. VARIABLES PREANALITICAS
• Efectos fisiologicos.
• Metodos de recolección y almacenamiento de muestras
• Manipulación y transporte de las muestras.
FACTORES FISIOLOGICOS:
• Estrés físico –sicologico
• Ejercicio.Cambios posturales.
• Variaciones diurnas.
• Variabilidad en el metabolismo.
• Secreción episodica de las hormonas.

36. VARIABLES PREANALITICAS
FACTORES :
 La mayor parte de las variables pre-analíticas tienen poco
efecto en la determinación de TSH. (Anticuerpos heterófilos -
HAMA)
 La presencia de sustancias interferentes en la muestra,
pueden influir en la unión de las hormonas tiroideas a las
proteínas plasmáticas, y así disminuir la exactitud de un
diagnóstico basado en las determinaciones de hormonas
tiroideas totales y libres más que en las de TSH

37. TSH
Intervalo de medición:
0.005 – 100 uUI/mL
Valores >100 dil 1/10 >1000 uUI/mL
V.R 0.27 – 4.20 uUI/mL
Limite inferior de detección: 0.005 uUI/mL
Sensibilidad funcional:0.014 uUI/mL
No reacciones cruzadas con LH- FSH-hGH-hCG.
TSH -T4L -T3L
Refrigerada 2-8ºC: 7 días
Congelado -20ºC: 1 mes (una sola vez)
TPO – AC. Tiroglobulina
Refrigerada 2-8ºC: 3 días
Congelada -20ºC: 1 mes
V.R < 34 UI/mL V-R <115 UI/mL
Anticuerpos Anti Receptor TSH
Suero. AYUNO. Libre de lipemia.
Refrigerada 2 - 8 °C: 3 días
Congelada -20ºC: 1 mes
Tiroglobulina
Refrigerada 2-8ºC: 24 horas
Congelada -20ºC: 2 meses
V.R 3.5 -77 ng/mL
Estabilidad de la muestra
Calcitonina
Suero. AYUNO. Libre de lipemia.
Centrifugar, separar y congelar
inmediatamente en tubo plástico estéril.
Congelada -20ºC: 15 días
Valor de referencia:
Mujeres: No Detectable – 11.5 pg/mL
Hombres: No Detectable – 18.2 pg/mL

38. Heparina
Dopamina
Glucorticoides
Dosis elevadas
Anticonvulsivantes
Amiodarona
Aines-
Furosemida
Hipoferritinemia Macro TSH
Anticonceptivos
Medicamentos y
condiciones
TSH 
T3
Que es lo normal ? TENER en cuenta………
Discordantes
TSH T4 T3
INTERFERENTES

39. VARIABLES ANALITICAS
FACTORES ANALITICOS:
• Alto nivel de variaciones estructurales de hormonas (HCG)
• Amplia disponibilidad de diferentes IEs tipo sandwich que
usan diferentes combinaciones de Acs.
• Estandarización inadecuada, por el uso de estándares de
referencia impuros.
• Temperatura
• Tiempo de incubación

40. VARIABLES ANALITICAS
 Variables analíticas: La variabilidad biológica inter- e intra-
individuales sugiere que las magnitudes de las diferencias
entre dos resultados de ensayos tiroideos sean clínicamente
significativas, cuando se evalúa la respuesta de un paciente al
tratamiento.
 Diferencia entre controles y muestras: la matriz es diferente y
puede haber alteración en las pruebas.

41. VARIABLES POSANALITICAS
 Error de valores de referencia.
 Transcripción y validación de resultados.
 Interpretación de lo medido.
 Tiempo de respuesta.
 No reportados.

43. Efectos de la edad cronológica sobre
los rangos de referencia de los
ensayos tiroideos
NEONATOS – INFANTES – NIÑOS:
 El eje hipotálamo-hipófisis-tiroideo madura durante la infancia hasta
el final de la pubertad.
 Las concentraciones de TSH y T4L son más altas en niños,
especialmente en la primera semana de vida y durante el primer año.
 No reconocer esto podría provocar la pérdida del diagnóstico o el
subtratamiento de casos de hipotiroidismo congénito.
 Deberían usarse valores de referencia ajustados por edad para todos
los ensayos.
ADULTOS:
 A pesar de que ciertos estudios muestran diferencias leves entre
individuos jóvenes y de mayor edad, no es necesario desarrollar
rangos de referencia ajustados por edad en adultos, para hormonas
tiroideas ni para TSH.

44. EDAD Rangos de
TSH mUI/L -
µUI/ml
Rangos de T4L
ng/dL
Rangos de T3L
pg/mL
Recién nacidos a
termino 0- 3 días
5.17 – 14.6 0.66 - 2.71 1.97 - 7.87
4 - 30 días 0.43 – 16.1 0.83 – 3.09 1.96 - 5.24
2 - 12 meses 0.62 – 8.05 0.48 – 2.34 1.55 – 6.38
2 - 6 años 0.54 – 4.53 0.85 – 1.75 1.96 – 5.95
7 - 11 años 0.66 – 4.14 0.90 – 1.67 2.68 – 5.16
Adolecentes
12 - 19 años
0.53 – 3.59 0.93 - 1.6 2.28 – 5.01
Adultos Eutiroideos 0.27 – 4.2 0.93 – 1.7 2.0 – 4.4
LIH: Rangos de referencia para TSH y T4L
Reference Range for Adults and children.
Preanalitical Conditions ELECSYS® Thyroid Tests

45. EDAD Rangos de T4
nmol/L
Rangos de T3
nmol/L
Recién nacidos a
termino 1- 3 días
141- 270 1.54 – 11.4
1 - 4 semanas 105 - 214 1.4 – 4.6
1 - 12 meses 93 - 200 1.6 – 3.8
1 - 5 años 94 -193 1.6 – 4.1
5 - 10 años 82 - 171 1.4 – 3.7
Adolecentes
12 - 19 años
59 – 154 1.3 – 3.1
Adultos Eutiroideos 59 – 154 1.3 – 3.1
LIH: R.R para T4 Totales T3 Totales
Reference Range for Adults and children.
Preanalitical Conditions ELECSYS® Thyroid Tests

46. Diagnóstico: Pruebas Tiroideas
TSH
Alto
TSH
Bajo
Hipotiroidismo
Hipertiroidismo
T4 L
T3 T-L

47. HIPERTIROIDEO
Borderline
Estado
Eutiroideo Hipotiroideo
Sospecha
No realizar
màs
pruebas
Muy baja
(<0.01 µIU/mL)
Ligera
Supresión TSH Normal
TSH
Elevada
TSH
Medir
T4 Libre
T3 Libre
Medir
T4 Libre
T3 Libre
Medir
T4 Libre

48. Hipotiroidismo Subclínico
TSH
Alto
Hipotiroidismo
T4 y T3 “Normales”
Si sólo se modifica la TSH es subclínico
Falla tiroidea leve o compensada
Am Fam Physician. 2005 Oct 15;72(8):1517-24. Subclinical thyroid disease.

49. Validación de métodos
Objetivos específicos:
1. Verificar precisión y exactitud en las dos técnicas
(diferencias?)
2. Error sistemático estadísticamente significativo?
Concentraciones medicas importantes?
3. Verificar límite de detección
4. Verificar linearidad
5. Validar los valores poblacionales establecidos por el
fabricante.

50. Validación
procedimiento
Diseño de fase experimentales con el fin de:
Verificar límite de detección
Verificar linearidad
Estimar imprecisión (%CV) bajo condiciones de
repetibilidad.
Estimar imprecisión (%CV) bajo condiciones de
reproducibilidad
Estimación de inexactitud o Sesgo entre los dos
métodos (Comparación).

51. Validación de métodos
Materiales requeridos:
Control de calidad interno
(3ra opinión/independiente)
Muestras de pacientes: con concentraciones
que evalúen parte baja, media y alta de la
curva de calibración. Mayor interés rango de
decisión clínica.
Calibradores o estándares de concentración
conocida.

52. CONTROL DE CALIDAD
Todo estudio cuantitativo debe reunir una serie
de requisitos que indican la confiabilidad de sus
resultados y la posibilidad de practicarlo
adecuadamente y bajo las condiciones que
requieren el paciente , el médico y la
normatividad legal.

53. CONTROL DE CALIDAD INTERNO
 Tres niveles de control – bajo –
medio – alto
 Procesar los controles como
las muestras en todos los
ensayos.
 Monitorear el desempeño de
los métodos y la presición
aplicando las curvas de Levy-
Jennings y reglas de Westgard

54. CONTROL DE CALIDAD EXTERNO
 Comprobación retrospectiva y objetiva de los
resultados realizada por una organización externa.
 Establece comparación con otros laboratorios.
 Realización periódica.
 VERIFICAN EXACTITUD

55. Tener en cuenta en CALIDAD
• La reactividad cruzada se puede determinar
efectuando distintas curvas con la sustancia en
estudio y aquellas otras sospechosas de compartir
propiedades antigénicas.
• La falta de paralelismo de las curvas indica que las
sustancias no son inmunológicamente similares. Para
eliminar la inmunidad cruzada se debe disponer del
anticuerpo con mayor afinidad por la molécula a
medir.

56. Recordar concepto ERROR TOTAL
• Es el error máximo aceptable para
una prueba sin invalidar su utilidad
médica.
• Es la sumatoria del error aleatorio
(EA) mas el error sistemático (ES)

57. ¿Qué es Seis Sigma?
• Seis Sigma es una estrategia de mejora continua que busca
identificar las causas de los errores, defectos y retrasos en los
diferentes procesos, enfocándose en los aspectos que son
críticos para el cliente.
• La estrategia Seis Sigma se basa en métodos estadísticos
rigurosos que emplean herramientas de calidad y análisis
matemáticos, ya sea para diseñar productos y procesos o para
mejorar los ya existentes.

58. Seis sigma
• Metodológicamente: Es una estrategia de mejora
continua que busca encontrar y eliminar causas de
errores o defectos en los procesos enfocándose en las
variables de importancia crítica para los clientes.
• Métricamente: Es una medida de la calidad.
• Mientras más grande es el valor de sigma de un proceso,
producto o servicio, su calidad es mejor
• Seis sigma significa 3,4 defectos por millón de errores
en un proceso.

59. Seis sigma
• Una de las principales diferencias entre la aplicación de
sigmametría analítica y el control de calidad tradicional
consiste en pasar de pensar los errores en términos de
porcentaje (%), para pensarlos como defectos por millón
de eventos u oportunidades (dpmo).
• Un defecto seis sigma es definido como cualquier
evento que lleve a un producto a que no cumpla con las
especificaciones del cliente. Para nuestro caso en
“calidad analítica” es un resultado que se encuentre por
fuera del error total permitido.

60. Métrica Seis Sigma
• La letra griega “Sigma” (σ) es utilizada en
estadística para denominar la desviación
estándar (medida de dispersión de los datos
respecto al valor medio).
• Mientras más alto sea el “Sigma” es menor la
desviación estándar, el proceso es mejor,
más preciso y menos variable.

61. Gráfica del cambio de un proceso con una calidad tres sigma a
uno con calidad seis sigma

62. SATIS.= SATISFACTORIO
EXCELE.= EXCELENTE
MATRIZ DE CALIDAD ANALITICA 1

63. SATIS.= SATISFACTORIO
EXCELE.= EXCELENTE
MATRIZ DE CALIDAD ANALITICA 2

64. Recomendación
 A pesar de los avances en los instrumentos de
medición y las mejoras en la sensibilidad y
especificidad de los ensayos actuales, todavía
se observa variabilidad método a método y
susceptibilidad a las interferencias.
 Integrar los aspectos técnicos de las pruebas
bioquímicas con los criterios de
comportamiento analítico necesarios para su
óptima utilización clínica en un entorno global
cada vez más sensible a los costos.

65. Recomendación
 La importancia de la relación entre el laboratorio y los
médicos. Actuar en forma conjunta y eficaz
 Informar introducción o cambio de método.
 Resultado discordante con la clínica del paciente
 Los laboratorios, a su vez, debemos definir, a partir de
nuestros métodos, un perfil de eficiencia óptimo.
 Es importante solicitar a los fabricantes toda la
información necesaria sobre sus productos para poder
elegir el IE con el criterio más adecuado.

66. Recomendaciones para la medición de
hormonas
La gestión de calidad en los laboratorios clínicos implica el control del proceso en
su totalidad, incluyendo las fases preanalítica, analítica y postanalítica.
La fase preanalítica corresponde a todos los pasos que se deben seguir en
orden cronológico, partiendo desde la solicitud del examen por parte del
clínico, preparación del paciente, toma de muestra, transporte hacia y dentro
del laboratorio, y termina cuando se inicia el procedimiento analítico.
La fase analítica involucra el análisis de la muestra o espécimen, realizado
por personal competente.
Fase posanalítica, la revisión del informe, la validación del resultado por
parte del bacteriólogo correlación clínica debe interpretarse con los datos
clínicos del paciente para la entrega al usuario y medico.

67. Recordar Limitaciones en las Pruebas
Tiroideas
Diferencia entre controles y muestras: la matriz es
diferente y puede haber alteración en las pruebas.
Aspectos fisiológicos: Edad, Embarazo
Medicamentos: glucocorticoides, dopamina, agonistas
dopaminérgicos (cabergolina), amiodarona,
colestiramina,estrógenos, tamoxifeno, etc.

68. Tener en cuenta otros factores que afectan la
determinación de hormonas tiroideas
• En embarazo: evaluar cada
trimestre en caso de
hipotiroidismo.
• Se deben reportar valores de
referencia para cada trimestre.
• OTROS FACTORES
 Medicamentos que disminuyen la
TBG: Andrógenos, Danazol, Acido
nicotínico.
 Medicamentos que aumentan la
TBG: Estrógenos.
TSH mUI/ L
< 2.5 1er Trim
<3 2do Trim
<3 3er Trim

69. RESUMEN

70. SOLO HAY UNA
OPORTUNIDAD PARA
HACERLO BIEN Y A
TIEMPO.
La comunicación con el clínico
es “Indispensable”
Gracias.