Este documento describe la técnica de Western blot, la cual permite detectar proteínas específicas en una muestra. En primer lugar, las proteínas son separadas mediante electroforesis en un gel. Luego son transferidas a una membrana, donde se unen anticuerpos específicos que permiten identificar la proteína de interés. Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo a través de métodos como la actividad enzimática o la fluorescencia. El Western blot es una herramienta analítica útil para identificar proteínas en mue
Electroforesis de proteínas del suero: Fundamento y utilidad
1. Jenny Maribel Dávila García
Luisa Fernanda Díaz Díaz
Daniel Alejandro Elizondo Alfaro
Martin Guillermo Esquivel Tapia
Fundamento y utilidad de la técnica de electroforesis de
Proteínas del suero
2. ¿Qué es la
Electroforesis de Proteínas?
La electroforesis de proteínas es una prueba de
laboratorio basada en la separación de proteínas
aplicando un campo eléctrico, las diferentes
proteínas de la mezcla se separarán en función de su
peso molecular.
3. Los diferentes tipos de análisis
pueden ser distinguidos por las
propiedades físicas de la muestra
que van a emplear para su
separación o por el tipo de matriz
usada
Limite Móvil
De zona
Isotacoforesis
Isoelectroenfoque
4. ARNE TISELIUS
• Bioquímico sueco
• Creo el primer aparato
• sofisticado de electroforesis en
1937.
• Su trabajo le valió el premio Nobel
en 1948.
• Fue quien desarrollo el concepto
de frente móvil, que mas tarde se
conoció como electroforesis de
zona y se uso para separar
proteínas en solución.
5. cirrosis, hepatitis autoinmune, artritis reumática,
osteomielitis, bronquitis, leishmaniosis, lepra,
leucemia, SIDA, mieloma, carcinomas, embarazo,
diabetes, daño celular, infecciones agudas,
desordenes renales y desnutrición.
¿Cual es su importancia?
Los niveles obtenidos son útiles para diagnosticar
gammapatias monoclonales (asociadas al cáncer)y
diversas patologías entre algunas:
6. LAS PROTEINAS PLASMATICAS
• El plasma, a menudo no permite
determinar los cambios en los
niveles de las beta y gamma
globulinas.
• El suero sanguíneo es el liquido
amarillo que resulta después de
formarse el coagulo sanguíneo, en
el están contenidas una gran
cantidad de proteínas, este carece
de fibrinógeno, fibrina y varios
factores de coagulación.
7. • Contiene dos principales grupos de proteínas:
albumina y globulinas.
• La albumina al igual que la α y β globulinas son
sintetizadas en el hígado
• Las γ globulinas son producidas por linfocitos y
células plasmáticas.
8. • 1. Albumina. Principal proteína del plasma humano y
constituye aproximadamente el 60% de la proteína
plasmática total. Trasporta atreves del torrente sanguíneo
muchos metabolitos, como los ácidos grasos libres y la
bilirrubina, también se unen a metales como el calcio,
cobre, zinc,; y a fármacos poco solubles , transportándolos
eficazmente. Ayuda a mantener la presión osmótica de la
sangre
5 grupos o fracciones proteicas en la sangre,
de tamaño, forma y carga similares.
α -1-Globulinas. En esta fracción se incluyen α-1-
antitripsina, glicoproteínas y lipoproteínas de alta
densidad HDL, colesterol «bueno» .
9. α-2-Globulinas. Haptoglobulina, que es una proteína que se une
a la hemoglobina libre para evitar su excreción por los riñones
α-2 macroglobulina (inhibidor de proteasas), ceruplasmina
(proteína transportadora de cobre y lipoproteínas de muy baja
densidad (VLDL), entre otras.
β-Globulinas. Transferrina (proteína transportadora del hierro), el
plasminogeno y el complemento, la hemoglobina libre y las
lipoproteínas de baja densidad LDL.
10. γ-Globulinas. Inmunoglobulinas o anticuerpos,
proteínas producidas por el sistema inmune en
respuesta a infecciones, reacciones alérgicas y
trasplantes de órganos,. Los anticuerpos se dividen en
IgA, IgE, IgD, IgM e IgG.
11. Valores normales
• Proteína total: 6.4 a 8.3 g/dL
• Albúmina: 3.5 a 5.0 g/dL
• Alfa-1 globulina: 0.1 a 0.3 g/dL
• Alfa-2 globulina: 0.6 a 1.0 g/dL
• Beta globulina: 0.7 a 1.2 g/dL
• Gammaglobulina: 0.7 a 1.6 g/dL
Los resultados de la electroforesis
de proteínas séricas pueden verse
afectados por:
- El consumo de medicamentos
como la clorpromazina,
corticosteroides, isoniazida,
neomicina, fenacemida,
salicilatos, sulfonamidas y
tolbutamida.
- Uso de colorantes de contraste
pueden alterar los resultados.
13. Las proteinas en el
suero reaccionan con
el SDS
El SDS contribuye a
que la proteína pierda
su plegamiento y las
carga negativamente
La mezcla de proteinas
desnaturalizadasse
colocan en los pocillos
del gel de policrilamida
Reacción
14. Usando una fuente de energía los polipéptidos
cargados negativamente migran hacia
el polo positivo en el fondo del gel.
16. Valores normales de las fracciones
proteicas del suero
Fracción Porcentaje con respecto a
las Proteínas Séricas
Totales (%)
Concentración expresada
en gramos por decilitro
(g/dL)
Albúmina 54.7 – 60.2 3.5 – 5.5
α – 1 globulina 1.6 – 3.6 0.2 -0.4
α – 2 globulina 9.4 – 12 0.5- 0.9
β globulina 10.9 – 14.5 0.6 – 1.1
γ globulinas 10.9 – 19.3 0.7 – 1.7
17. Mediante la electroforesis pueden
separarse y cuantificarse un gran numero
de proteínas presentes en el suero sin
embargo los resultados pueden verse
afectados por el consumo de
medicamentos como clorpromazina,
neomicina, corticoesteroides, fenacemida
entre otros.
Patologías
detectadas por
electroforesis
18. Albumina
• Elevación por encima de niveles normales:
deshidratación.
• Disminución por debajo de los niveles
normales: malnutrición, hepatopatías como
cirrosis, nefropatías, hiperhidratacion,
enfermedades inflamatorias.
19. A-1 globulinas
• Elevación por encima de niveles normales:
inflamaciones crónicas por ejemplo artritis
reumatoide, lupus eritematoso y inflamaciones
agudas.
• Disminución por debajo de los niveles normales:
enfisema pulmonar juvenil.
20. A-2 globulina
• Elevación por encima de niveles normales:
inflamaciones agudas y crónicas.
• Disminución por debajo de los niveles
normales: hemolisis, insuficiencia hepática y
enfermedad de Wilson.
21. B globulinas
• Elevación por encima de niveles normales:
hiperlipoproteinemia.
• Disminución por debajo de los niveles
normales: trastorno de coagulación congénito,
malnutrición, coagulopatia de consumo.
22. Y globulinas
• Elevación por encima de niveles normales: mieloma
múltiple, artritis reumatoide, hiperinmunizacion,
macroglobulinemia de Waldenstrom.
• Disminución por debajo de los niveles normales:
inmunodeficiencias secundarias y trastornos
inmunológicos congénitos.
23. Karla Judith Franco Andrade
María José García Madrigal
Mario José Garza López
Fundamento y utilidad de la técnica de
ELISA
24. ¿Qué es?
Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay
Es una prueba para la detección
de moléculas usando el
reconocimiento de antígeno-
anticuerpo y la sensibilidad de
pruebas enzimáticas
Prueba inmunoabsorbente ligado
a enzimas
Es un ensayo inmunoenzimatico
para detectar moléculas que
sufren cambio al presentarse
infecciones por virus, bacterias,
hongos o parásitos.
ELISA
30. La prueba sirve para detectar antígenos,
anticuerpos, medicamentos drogas de abuso
contaminantes químicos y bacterianos, etc.
31. • La interacción antígeno-anticuerpo en
el laboratorio puede ser utilizada para
determinar si un paciente tiene una
infección o una enfermedad
autoinmune.
32. Un resultado positivo que confirma la presencia
de anticuerpos no significa necesariamente que
el paciente esté enfermo. El cuerpo de una
persona que ha estado enferma y que ya se ha
recuperado, puede seguir produciendo
anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
33. Hay personas que producen una baja cantidad
de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar
desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a
un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de
personas que padezcan una inmunodeficiencia,
o que se encuentren en el periodo ventana de la
infección en el momento de realizar la prueba, o
que estén infectadas por una cepa extraña.
34. • La prueba es especifica, fácil para la
automatización de robots para hacer muchas
pruebas en corto tiempo, es barato.
35. Se emplea para la presencia de anticuerpos contra
agentes virales.
Se emplea para identificar la presencia de antígenos de
superficie virales.
Detecta anticuerpos contra bacterias
36. • Determinación de
antígenos o marcadores
tumorales para seguir su
evolución o la respuesta a
tratamiento
• Cuantificación de
medicamentos en sangre
• Cuantificación de drogas en
abuso
37. Primer paso
Los antígenos se pegan a una placa de cloruro de polivinilo
o poliestireno; también se pueden pegar anticuerpos.
39. Tercer paso
Después de la reacción antígeno-anticuerpo se utiliza
un segundo anticuerpo, conjugado a una enzima,
especifico para el isotipo del anticuerpo a cuantificar.
40. 4 Cuarto paso
Se agrega el sustrato cromógeno que produce un cambio
de coloración.
41. 5 Quinto paso
En un espectrofotómetro se produce una lectura
de absorbancia, directamente proporcional a la
concentración del analito a determinar.
43. Mario Rene Gracia Cavazos
Jonathan González Dávila
Cynthia Jazmín Guevara Rojas
Fundamento y utilidad de la técnica de
WESTERN-BLOT
44. Western Blot
• Es una técnica analítica usada para detectar proteínas
específicas en una muestra determinada (una mezcla
compleja de proteínas, como un extracto tisular)
• El Western blot fue desarrollado en el laboratorio
de George Stark, en la Universidad de Stanford.
45. Antecedentes
• En 1975, Edwin Southern demostró
que la nitrocelulosa era capaz de
capturar ácidos nucleicos
separados previamente por
electroforesis. De esta forma, se
permitía el análisis de una mezcla
compleja de moléculas de ADN.
• Existen diversas técnicas capaces
de detectar un antígeno
determinado en una muestra,
como la inmunoelectroforesis.
• La aparición del Western no fue
posible hasta la aparición de las
membranas.
46. • Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas
atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura,
hidrofobicidad
• Luego son transferidas a una membrana adsorbente para poder
buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra
ella.
• Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad
enzimática, fluorescencia entre otros métodos.
47. Preparación
de
la
muestra
Las muestras pueden
ser tomadas de
un tejido entero o de
un cultivo celular.
Una pequeña
cantidad del tejido se
introduce en un
buffer de extracción.
Después se procede
a una licuadora (para
muestras pequeñas).
Por último se
centrifuga para
obtener las proteínas
en el sobrenadante,
la fracción no
precipitada.
48. Materiales
• Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 °C)
para evitar la desnaturalización proteica. Para separar
proteínas de compartimentos y orgánulos celulares es
preciso combinar técnicas mecánicas - como filtraciones
y bioquímicas.
49. Electroforesis en Gel
• Las proteínas de la muestra serán separadas
en gel en función de lo siguiente:
– Punto isoeléctrico
– Peso molecular
– Carga eléctrica
50. • La electroforesis con gel mas frecuente es la de poliacrilamida
con dodecil sulfato (SDS-PAGE).
• Provoca la eliminación de las estructuras secundarias y
terciaras de las proteínas y mantiene a los polipéptidos en
estado desnaturalizado. Esto permitirá que las proteínas sean
separadas en función del tamaño.
51. Transferencia
• Para que las proteínas sean accesibles a la detección de
anticuerpos, se les transfiere desde el gel de poliacrilamida a
una membrana de nitrocelulosa o de polifluoruro de
vinilideno (PVDF).
• Las membranas utilizadas en la prueba Western Blot se
caracterizan por su capacidad de unir proteínas de forma
inespecífica.
52. Membrana de Nitrocelulosa
• En esta membrana ocurren interacciones membrana-proteína
de tipo no covalente, con naturaleza hidrófoba.
53. Membrana de PVDF
• Son interacciones hidrofóbicas y de dipolos.
• Deben ser humedecidas en metanol o etanol, debido a su alta
hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.
54. Electrotransferencia
• Este método se basa en una corriente eléctrica y un buffer de
transferencia para llevar las proteínas desde el gel hasta la
membrana.
55. • Despues de la transferencia se suele proceder a la
tinción de Coomassie Brilliant Blue para comprobar
que se ha transferido suficiente material proteico a la
membrana.
57. Se incuba la
membrana solución
de proteínas
Albumina de suero
bovino o ASB o
caseína + fracción
de detergente
58. Detección
Se comprueba la presencia en la membrana de la proteína.
Se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a enzima
que, en presencia de su sustrato, catalice una reacción
colorimétrica.
Proceso tradicionalmente realizado en dos pasos, aunque
ahora es posible la detección en un único paso.
60. Método en
paso
Requiere un anticuerpo que
reconozca al mismo tiempo la
proteína de interés y una
"etiqueta" detectable.
Se incuba de manera similar al
anticuerpo primario del proceso
en dos pasos, y, tras una serie de
lavados, ya se puede detectar
directamente.
61. Análisis
Se pueden examinar la
cantidad de proteínas en
una muestra y comparar
los niveles de presencia
entre varios grupos.
Tras el lavado de las
sondas marcadas no
unidas, se procede a
la detección de
aquellas que sí se
han unido a la
proteína de interés.
Resultados
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