El documento describe diferentes tipos de microscopía como la óptica, de fluorescencia, confocal y electrónica, y cómo cada una permite observar estructuras a diferentes escalas. También explica conceptos como longitud de onda, límite de resolución e índice de refracción, y cómo se aplican estas técnicas para visualizar células y tejidos vivos y fijados. Finalmente, introduce los conceptos de cultivos celulares primarios y de líneas celulares continuas.

1. Microscopía de luz, de fluorescencia, confocal y de electrones.
Espectro de radiación electromagnético.
En fenómenos de reflexión y refracción, el fotón se comporta como una onda.En
fenómenos de transferencia de energía, el fotón se comporta como un corpúsculo,
donde la energía está dada por:
Longitud de onda, Distancia entre 2 máximos de una onda. Este parámetro
determina el color de las cosas.
La distancia límite en lo que dos objetos pueden verse separados se llama límite
de resolución, que depende tanto de la longitud de onda de la luz, como la
apertura numérica del lente utilizado por el sistema.
Microscopía blanca: 400-700 nm Microscopía de fluorescencia (UV) -300 nm
Microscopía electrónica: 0.004 nm
Las microscopías tienen funciones tales como, ver cuando se expresa una
proteína, ver donde se expresa la proteína, asociar entre proteína y estructura
celular.
Una manera más sencilla de observar algunas de las características de una célula
consiste en utilizar una luz dispersada por sus diversos componentes. En el
microscopio de contraste oscuro, los rayos luminosos del sistema de
iluminación son dirigidos desde la parte lateral, por lo que sólo penetra en las
lentes del microscopio la luz dispersada. Por lo que la célula aparece brillante en
un fondo negro.
Con un microscopio de campo claro convencional, la imagen se obtiene por la
simple transmisión de la luz a través de las células en cultivo
Para poder observar un tejido al microscopio óptico convencional se deben
cortar en finas secciones, cuanto más fina sean las secciones, mejores definidas
serán las imágenes.
Cuando la luz pasa a través de una célula viva, la fase de la onda luminosa varía
con respecto al índice de refracción de la célula, la haz de luz que pasa a través
de una zona relativamente gruesa o densa de la célula, como por ejemplo el
E
=

h
c

2. núcleo, se retrasa, y como consecuencia de esto la luz queda desplazada
respecto a la luz que paso a través de una zona más delgada como el citoplasma.
El microscopio de contraste de fases y de una forma más compleja, el
microscopio de contraste de fases interferencial, aprovechan las diferentes
interferencias que se producen cuando se combinan estos dos grupos de
estructuras. Ambos tipos de microscopios ópticos son utilizados para visualizar
células vivas.
Una de las grandes ventajas del microscopio de contraste de fases, el microscopio
de fases interferencial y el microscopio de campo oscuro radia en que los pueden
permiten observar las células en acción y estudiar los desplazamientos implicados
en procesos como la mitosis o migración celular (cuando los procesos son
demasiados lentos, resulta útil filmar una película gracias al sistema de
aceleración de movimiento)
Los colorantes fluorescentes utilizados para la tinción celular son visualizados con
la ayuda del denominado microscopio de fluorescencia. Este microscopio es
similar al microscopio óptico convencional, a excepción de que la luz incidente,
procedente de una potente fuente, atraviesa dos series de filtros - uno para
interceptar la luz antes de que llegue a la muestra y otro para filtrar la luz que se
obtiene a partir de la muestra. El primer filtro se selecciona de manera que sólo
permita el paso de las longitudes de onda que excitan al colorante fluorescente
concreto que se ha utilizado, mientras que el segundo filtro bloquea esta luz y sólo
permite el paso de las longitudes de onda que emite el colorante una vez excitado.
La microscopía de fluorescencia se utiliza por lo general para detectar
específicamente proteínas u otras moléculas en células y tejidos. Una técnica muy
utilizada y potente consiste en acoplar de forma covalente un colorante
fluorescente a moléculas de un anticuerpo, el cual puede ser utilizado como un

3. reactivo específico y versátil, debido a que se une de manera selectiva a las
macromoléculas que reconoce en las células o en la matriz extracelular.
El microscopio confocal,lo hace manipulando la luz antes de que ésta sea medida;
por tanto no es una técnica digital sino analógica. Los detalles ópticos del
microscopio confocal son complejos, pero la idea básica es sencilla y los
resultados son muy superiores a los obtenidos por la microscopia óptica
convencional. El microscopio utiliza una óptica fluorescente, pero en lugar de
iluminar toda la muestra a la vez, como se hace habitualmente, en cada instante el
sistema óptico enfoca un pequeño punto luminoso en una profundidad
determinada de la muestra. Se necesita una fuente de luz que produzca puntos
luminosos muy brillantes; habitualmente se utilizan fuentes láser cuya luz haya
pasado a través de un diafragma. La fluorescencia emitida por el material
iluminado se recoge y produce una imagen a la entrada de un detector de luz
adecuado. Se coloca un diafragma en el detector. En el lugar que es confocal con
el punto luminoso, que es precisamente donde los rayos luminosos emitidos por el
punto .iluminado de la muestra están enfocados. Así la luz de este punto de la
muestra converge sobre esta apertura y entra en el detector. Por lo contrario, la
luz que procede de las regiones situadas fuera del plano focal del punto luminoso
también está fuera de foco en el diafragma, por lo que resulta en gran manera
excluida del detector. Para obtener una imagen bidimensional se recoge de forma
secuencial la Información de cada punto luminoso del plano focal mediante un
barrido por todo el campo a observar (como ocurre en una pantalla de televisión) y
se proyecta en una pantalla de vídeo. A pesar de que no se presenta en la Figura
9-20, el barrido se obtiene por reflexión del haz luminoso en un espejo oscilante
situado entre el espejo dicroico y las lentes del objeto de tal forma que el punto
luminoso y el diafragma confocal del detector permanezcan en registro. El
microscopio de barrido confocal se ha utilizado para resolver estructuras de
numerosos objetos tridimensionales complejos
Microscopía electrónica.
a) Microscopía electrónica de transmisión
En esta técnica la preparación teñida es traspasada por un haz de electrones, lo
cual proporciona la imagen ultrafina sobre una pantalla ad hoc. El microscopio
electrónico de transmisión es capaz de generar un haz de electrones a alta tensión
(80kV) y concentrarlo sobre la preparación mediante un complejo sistema de
campos electromagnéticos equivalentes a las "lentes" del microscopio de luz. La
mayor utilidad de la microscopía electrónica de transmisión es en Oncología.
b) Microscopía electrónica de barrido

4. La microscopía electrónica de barrido permite el estudio de superficies
celulares. La imagen se obtiene rastreando la superficie de la muestra con un haz
electrónico ultrafino. Las señales generadas se recolectan, amplifican y captan en
un tubo de rayos catódicos. Se utiliza en forma rutinaria en el estudio de
enfermedades del tallo piloso. En estas condiciones hay anomalías estructurales y
de superficie de los pelos, que pueden identificarse fácilmente con esta técnica.
De esta forma, es posible incluso establecer un pronóstico de reversibilidad de las
alteraciones utilizando esta técnica.
La criomicroscopía electrónica es una forma de microscopía electrónica en la que
la muestra se estudia a temperaturas criogénicas, evitando así la generación de
artefactos. Se trata de una técnica muy utilizada en biología estructural, pues
permite observar directamente (sin tinciones ni fijaciones) estados
conformacionales nativos a resolución atómica.
Cultivos celulares: El cultivo celular o cultivo de tejidos, tiene su origen en el
siglo XIX, como un método para el estudio del comportamiento de las células
animales libres de las variaciones sistémicas ocurridas dentro del organismo
durante su normal homeostasis y bajo el estrés de un experimento. Estas técnicas
iniciaron con el cultivo de fragmentos no disgregados de tejidos, los cuales
restringían la mitosis de las células cultivadas y por tanto su crecimiento
a) CULTIVOS PRIMARIOS
Los cultivos primarios tienen características especiales que los diferencian de
las líneas celulares: conservan la morfología de las células del órgano del que
fueron aisladas, sus cromosomas tienen un número diploide (2n), su
crecimiento in vitro es limitado y hay inhibición por contacto. El estar más
cercanas a las células que las originaron, se ve reflejado en una mejor
actividad y funcionalidad similar a su ambiente natural, por lo que en
aislamientos primarios de cepas virales éstas tienen mayor sensibilidad que
una Línea Celular ya establecida. Dentro de las desventajas está la de una
mayor probabilidad de presentar virus adventicios o latentes, lo que implica el
desarrollo de la adecuada tecnología para el control de calidad.
b) LINEAS CELULARES
Las Líneas Celulares continuas están formadas por células que se diferencian
genética y morfológicamente de las células de las cuales se originaron. Pueden
provenir de células que se derivan de tumores o de un proceso de
transformación de un cultivo primario mediante transfección con oncogenes o
con tratamiento con carcinogenéticos, lo que les confiere un nuevo fenotipo.
Este tipo de cultivo tiene la característica de no tener inhibición por contacto y
de crecer de manera indefinida. El paso de un cultivo primario a línea se
denomina transformación.