Este documento describe dos técnicas de microscopía: citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido. La citometría de flujo permite medir múltiples parámetros de células individuales marcadas con fluorocromos usando láseres y detección de fluorescencia. La microscopía electrónica de barrido usa un haz de electrones en lugar de luz para producir imágenes de alta resolución de la superficie de una muestra, revelando detalles a escala nanométrica. Amb

1. Citometría de Flujo y
Microscopía
Inmunoelectrónica
Mariano Martínez Suazo
Marianela Cantarero Zavala
Patricia Elena Ghattas
Julissa Gutiérrez Villanueva
Reina Noely Gomez
René Alberto Turcios
Roxana Dariela Godoy
Jesús Reyes
Andrea García

2. CITOMETRÍA DE FLUJO
• Un citómetro es un aparato
que mide células. Por lo
tanto, un Citómetro de Flujo
es un instrumento complejo
que combina conocimientos
avanzados de dinámica de
fluidos, iluminación Laser,
óptica y de procesamiento
electrónico y computacional
de las señales celulares.

3. ELEMENTOS DE UN CITOMETRO

4. COMO FUNCIONA
1. Primero, las células o partículas son marcadas
por colorantes fluorescentes.
2. La suspensión celular procesada y teñida
interaccionan físicamente con un haz de luz
monocromática, dispersando la luz en todas las
direcciones.
3. Esta interaccion da la emisión de una luz de
longitud de onda superior a la incidente, siendo
dirigidas las longitudes de onda seleccionadas
mediante espejos adecuados a detectores
fotomultiplicadores.

5. 4. Si existen múltiples fluorocromos estos
pueden unirse a las células permitiendo
medidas fluorescentes simultáneas de varios
parámetros de una sola célula.
5. Por ultimo, las señales eléctricas son
convertidas en señales digitales y son
procesadas por un ordenador, con el fin de
generar histogramas correlacionados con los
parámetros deseados y efectuar el análisis de
los mismos.

7. APLICACIÓN

8. INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS

9. MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE
BARRIDO
Es aquel que utiliza un
haz de electrones en
lugar de un haz de luz
para formar una
imagen. Tiene una gran
profundidad de campo
produciendo imágenes
de alta resolución donde
la muestra puede ser
examinada con gran
amplificación.

10. • La muestra generalmente es recubierta con
una capa de carbono o una capa delgada de
un metal como el oro para conferirle carácter
conductor. Posteriormente, se barre la
superficie con electrones acelerados que
viajan a través del cañón.

11. • Un detector formado
por lentes basadas en
electro imágenes, mide
la cantidad e intensidad
de electrones que
devuelve la muestra,
siendo capaz de mostrar
figuras en tres
dimensiones mediante
imagen digital.

12. PARTES
• Un MEB moderno consta
esencialmente de las
siguientes partes:
1. Una unidad óptica-electrónica
2. Un porta muestra
3. Una unidad de detección
de las señales que se
originan en la muestra.
4. Sistema de amplificación

13. 5. Un sistema de visualización de las imágenes (
tubo de rayos catódicos ).
6. Un sistema de vacío
7. Un sistema de refrigeración
8. Un sistema de suministro eléctrico
9. Un sistema de registro fotográfico, magnético
o de video.
10. Un sistema de procesamiento de la imagen
con ayuda computacional (optativo).

14. FUNCIONAMIENTO
1. Acelerar los electrones en un campo eléctrico lo
cual se lleva a cabo en la columna del
microscopio, donde se aceleran mediante una
diferencia de potencial de 1000 a 30000 voltios.
2. Dependiendo del voltaje pueden ser:
• Voltaje bajo para se utilizan para muestras muy
sensibles, como podrían ser las muestras
biologicas sin preparación adicional o muestras
muy aislantes.
• Los voltajes elevados se utilizan para muestras
metálicas.

15. 3. Los electrones acelerados salen del cañón, y se
enfocan mediante los lentes condensadores y
objetivos.
4. Con las bobinas deflectoras se barre este fino haz
de electrones sobre la muestra, punto por punto
y línea por línea.
5. Cuando el haz incide sobre la muestra, se
producen muchas interacciones entre los
electrones del mismo haz, y los atomos de la
muestra.
6. La energía que pierden los electrones al "chocar"
contra la muestra puede hacer que otros
electrones salgan despedidos), y producir rayos X,
electrones Auger, etc.