Este documento describe varias técnicas de estudio celular, incluyendo el microscopio óptico, microscopio electrónico de transmisión, microscopio electrónico de barrido, cultivo celular, técnicas inmunológicas como ELISA, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis, centrifugación y separación por sedimentación en gradiente de sacarosa. Explica los principios, partes y aplicaciones de cada técnica.

1. Métodos de estudio celular
Norma Cruz Tapia
IIIº Electivo Nº 5

2. Técnicas de estudio de la materia viva

3. ROBERT HOOKE

5. LEEUWENHOEK POPULARIZÓ EL USO DEL MICROSCOPIO (1964)

6. Microscopio óptico

8. Algunos Conceptos…
Magnificación Resolución (D)
Distancia mínima a la cual
Aumento que logra el el equipo puede mostrar
equipo dos puntos como
entidades separadas

9. CARACTERÍSTICAS
• AUMENTO: Producto del numero de aumentos de los lentes (ocular y
objetivo)
• RESOLUCIÓN: Capacidad para distinguir dos o mas puntos que parecen
uno.
• PROFUNDIZACIÓN: Capacidad para distinguir un plano de otro.
• CAMPO VISUAL: Área circular que se distingue al mirar por el microcopio.

10. PARTES DEL MICROSCOPIO
• SISTEMA MECÁNICO:
• PIE O BASE: Tres puntos de apoyo para dar estabilidad al microscopio
• BRAZO: Transporte del microscopio, sostiene al tubo y la platina.
• TUBO: conduce la imagen de la lente del objetivo a la ocular
• PLATINA: Lugar donde se deposita el portaobjetos, sujetándolo con dos
pinzas.
• CARRO: Desplaza la muestra.
• TORNILLOS DE ENFOQUE:
Macrométrico: Acerca o aleja el tubo de la platina.
Micrométrico: Da claridad a la imagen.

11. • SISTEMA ÓPTICO
• OCULAR: Amplia la imagen dada por la lente del objetivo.
• OBJETIVOS: Amplia la imagen de la muestra.
• CONDENSADOR: Enfoca la luz en la muestra.
• DIAFRAGMA. Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

12. MICROSCOPIO ÓPTICO
FUNCIONAMIENTO
• FUENTE DE LUZ
• LENTE CONDENSADORA
• MUESTRA
• LENTE OBJETIVO
• LENTE OCULAR
• OJO HUMANO

13. OPTICO CAMPO CLARO
• USA LA LUZ VISIBLE
• MUESTRA MUY FINA
• AUMENTO DE 1000X (100X
OBJETIVO, 10X OCULAR)
• IMAGEN DENTRO DEL CAMPO
MICROSCOPICO
• EL SISTEMA MECANICO
SOSTIENE EL SISTEMA OPTICO Y
LA MUESTRA.

14. ÓPTICO CAMPO OSCURO
• CONDENSADOR QUE REFRACTA LA
LUZ
• LUZ INTESA EN FORMA DE CONO
HUECO
• CAMPO NEGRO
• IMAGEN LUZ BRILLANTE SOBRE EL
FONDO
• SÓLO BORDES DESTACADOS DE LAS
MUESTRAS
• DIFICIL ACCESO.
• PREPARACION SIN COLOREAR

15. ÓPTICO CONTRASTE DE FASES
• REVELA DETALLES IMPERCEPTIBLES
CON UN MICROSCOPIO
CONVENCIONAL
• CONO DE LUZ ESTRECHO
• CÉLULAS VIVAS
• DETALLAR ESTRUCTURAS INTERNAS
• NO ES NECESARIO TEÑIR

16. MICROSCOPIA CONTRASTE DE FASES

17. ÓPTICO DE FLUORESCENCIA
• UTILIZA RANGO DE LUZ ULTRAVIOLETA
• ABSORVE SELECTIVAMENTE DIFERENTES LONGITUDES DE ONDA DEL
RANGO ULTRAVIOLETA
• ELEMENTOS ÓPTICOS HECHOS CON CUARZO O SITEMAS DE ESPEJOS
ALUMINIZADOS
• IMAGEN CON FOSFORESCENCIA
• FONDO OSCURO
• LAMPARA DE MERCURIO (FUENTE DE LUZ)
• AUMENTO DE RESOLUCION CON LONGITUD DE ONDA CORTA

18. MICROSCOPIA CON FLUORESCENCIA

19. MET

21. Microscopio Electrónico de Transmisión: MET
La MET no explora superficies: el haz de electrones incidente atraviesa la muestra
y genera una sombra de la ultraestructura que es capturada en una pantalla
fosforescente , ubicada en la parte inferior de la columna.
• Cañón de electrones, que emite los electrones que chocan contra el espécimen,
creando una imagen aumentada.
• Lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya
que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con
los electrones.
• Sistema de vacío es una parte muy importante del microscopio electrónico. Debido a
que los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe hacer un
vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características.
• Placa fotográfica o pantalla fluorescente que se coloca detrás del objeto a visualizar
para registrar la imagen aumentada.
• Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser
una computadora.

22. MEB

24. Microscopio electrónico de barrido
• En el microscopio electrónico de barrido la
muestra es recubierta con una capa de
metal delgado, y es barrida con electrones
enviados desde un cañón. Un detector
mide la cantidad de electrones enviados
que arroja la intensidad de la zona de
muestra, siendo capaz de mostrar figuras
en tres dimensiones, proyectados en una
imagen de TV.

25. Comparación microscopios electrónicos

26. DIFERENCIAS
• ÓPTICO • ELECTRÓNICO
• PORTAOBJETOS • REJILLA DE COBRE
• VIDRIO DE LUZ • HAZ DE ELECTRONES
• OCULAR • LENTES ELECTROMAGNETICOS DEL PROYECTOR
• OBJETIVOS • LENTES ELECTROMAGNETICOS DEL OBJETIVO
• CONDENSADOR • LENTES ELECTOMAGNETICOS DEL
CONDENSADOR

32. • Definición: Conjunto de técnicas que permite
el mantenimiento de las células “in vitro”,
manteniendo al máximo sus propiedades
fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
• Ventajas de realizar un cultivo celular
• Cultivo en microorganismos, cultivo en
animales, cultivo en vegetales.

33. CLASES DE CULTIVOS
PRIMARIOS: Se obtiene directamente de los
tejidos animales o vegetales.
SECUNDARIOS: Se obtiene de tomar una muestra
de los primarios y su nuevo cultivo en otra cápsula
de petri.
DE LINEAS ESTABLECIDAS: son los que derivan de
tumores

34. CÉLULAS COMO MODELO
EXPERIMENTALES
• Drosofila melanogaster
• La rana Xenopus laevis
• El pez cebra

35. CULTIVO CELULAS VEGETALES
• Las células vegetales tienen
una característica muy
interesante que es conocida
como totipotencia o
pluriopotencia. Lo cual ayuda
que en cultivo se puedan
generar otros tejidos.
• Células como modelo
experimental: Arabidopsis
thaliana

36. METODO DE LA
MICROMANIPULACION
• Se basa en la introducción en células y
tejidos de: microagujas, micropipetas,
microelectrodos; por medio de aparatos
especiales que permiten el movimiento
controlado de estos instrumentos bajo el
microscopio.

37. APLICACIONES DEL CULTIVO CELULAR
• Actividad intracelular
• Flujo intracelular
• Ecología celular
• Interacciones celulares
AREAS DE INVESTIGACION:
virología, investigación del
cáncer, inmunología,
ingeniería de proteínas.

38. VENTAJAS E INCONVENIENTES CON LOS
CULTIVOS CELULARES
• El control del medio
fisicoquímico.
• Caracterización y homogeneidad
de la muestra.
• Técnica sensible
• Los costos de producir células en
cultivo son diez veces mas que el
uso de tejido animal.

39. Técnicas inmunológicas

40. ELISA
ELISA Para detectar Antígenos
Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

41. ELISA
ELISA Para detectar Antígenos
Lavado Anticuerpo 2º Revelado

44. Cromatografía de intercambio iónico

45. Electroforesis

47. Centrifugación
• Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las
muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en
poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor
que la del medio que las rodea.
• Tipo:
– centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 g)
– super-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de
2000 g a 20000 g)
– ultracentrífugas (de 15000 g a 600000 g).
• En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara
para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la
fricción. En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de
100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vacío en
la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y
muestra.

48. Centrifugación: coeficientes de sedimentación
• El coeficiente de sedimentación de una partícula o
macromolécula se calcula dividiendo su velocidad constante de
sedimentación (en m/s) por la aceleración aplicada (en m/s2).
• El resultado tiene dimensiones de tiempo y se expresa
habitualmente en svedbergs (S).
• Los valores de coeficientes de sedimentación no son aditivos,
debido a que dependen tanto de la masa, como de la forma que
tenga la molécula. Una partícula formada por la unión de dos
partículas 5 S no tiene un coeficiente de sedimentación de 10 S.
Por ejemplo, los ribosomas eucarióticos están formados por dos
subunidades, una 60 S y otra 40 S. Sin embargo, el valor final del
conjunto del ribosoma no es 100 S, sino 80.

49. Centrifugación diferencial

50. Separación por sedimentación en gradiente
de sacarosa