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                              Distancia mínima a la cual
       Aumento que logra el    el equipo puede mostrar
            equipo                 dos puntos como
                                 entidades separadas
CARACTERÍSTICAS

• AUMENTO: Producto del numero de aumentos de los lentes (ocular y
  objetivo)
• RESOLUCIÓN: Capacidad para distinguir dos o mas puntos que parecen
  uno.
• PROFUNDIZACIÓN: Capacidad para distinguir un plano de otro.
• CAMPO VISUAL: Área circular que se distingue al mirar por el microcopio.
PARTES DEL MICROSCOPIO

• SISTEMA MECÁNICO:

• PIE O BASE: Tres puntos de apoyo para dar estabilidad al microscopio
• BRAZO: Transporte del microscopio, sostiene al tubo y la platina.
• TUBO: conduce la imagen de la lente del objetivo a la ocular
• PLATINA: Lugar donde se deposita el portaobjetos, sujetándolo con dos
  pinzas.
• CARRO: Desplaza la muestra.
• TORNILLOS DE ENFOQUE:
  Macrométrico: Acerca o aleja el tubo de la platina.
  Micrométrico: Da claridad a la imagen.
• SISTEMA ÓPTICO

•   OCULAR: Amplia la imagen dada por la lente del objetivo.
•   OBJETIVOS: Amplia la imagen de la muestra.
•   CONDENSADOR: Enfoca la luz en la muestra.
•   DIAFRAGMA. Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
MICROSCOPIO ÓPTICO
            FUNCIONAMIENTO

•   FUENTE DE LUZ

•   LENTE CONDENSADORA

•   MUESTRA

•   LENTE OBJETIVO

•   LENTE OCULAR

•   OJO HUMANO
OPTICO CAMPO CLARO

• USA LA LUZ VISIBLE
• MUESTRA MUY FINA
• AUMENTO DE 1000X (100X
  OBJETIVO, 10X OCULAR)
• IMAGEN DENTRO DEL CAMPO
  MICROSCOPICO
• EL SISTEMA MECANICO
  SOSTIENE EL SISTEMA OPTICO Y
  LA MUESTRA.
ÓPTICO CAMPO OSCURO

•   CONDENSADOR QUE REFRACTA LA
    LUZ
•   LUZ INTESA EN FORMA DE CONO
    HUECO
•   CAMPO NEGRO
•   IMAGEN LUZ BRILLANTE SOBRE EL
    FONDO
•    SÓLO BORDES DESTACADOS DE LAS
    MUESTRAS
•   DIFICIL ACCESO.
•   PREPARACION SIN COLOREAR
ÓPTICO CONTRASTE DE FASES
•   REVELA DETALLES IMPERCEPTIBLES
    CON UN MICROSCOPIO
    CONVENCIONAL
•   CONO DE LUZ ESTRECHO
•   CÉLULAS VIVAS
•   DETALLAR ESTRUCTURAS INTERNAS
•   NO ES NECESARIO TEÑIR
MICROSCOPIA CONTRASTE DE FASES
ÓPTICO DE FLUORESCENCIA

• UTILIZA RANGO DE LUZ ULTRAVIOLETA
• ABSORVE SELECTIVAMENTE DIFERENTES LONGITUDES DE ONDA DEL
  RANGO ULTRAVIOLETA
• ELEMENTOS ÓPTICOS HECHOS CON CUARZO O SITEMAS DE ESPEJOS
  ALUMINIZADOS
• IMAGEN CON FOSFORESCENCIA
• FONDO OSCURO
• LAMPARA DE MERCURIO (FUENTE DE LUZ)
• AUMENTO DE RESOLUCION CON LONGITUD DE ONDA CORTA
MICROSCOPIA CON FLUORESCENCIA
MET
Metodos de estudio celular
Microscopio Electrónico de Transmisión: MET
La MET no explora superficies: el haz de electrones incidente atraviesa la muestra
y genera una sombra de la ultraestructura que es capturada en una pantalla
fosforescente , ubicada en la parte inferior de la columna.

 •   Cañón de electrones, que emite los electrones que chocan contra el espécimen,
     creando una imagen aumentada.

 •   Lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya
     que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con
     los electrones.

 •   Sistema de vacío es una parte muy importante del microscopio electrónico. Debido a
     que los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe hacer un
     vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características.

 •   Placa fotográfica o pantalla fluorescente que se coloca detrás del objeto a visualizar
     para registrar la imagen aumentada.

 •   Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser
     una computadora.
MEB
Metodos de estudio celular
Microscopio electrónico de barrido

• En el microscopio electrónico de barrido la
  muestra es recubierta con una capa de
  metal delgado, y es barrida con electrones
  enviados desde un cañón. Un detector
  mide la cantidad de electrones enviados
  que arroja la intensidad de la zona de
  muestra, siendo capaz de mostrar figuras
  en tres dimensiones, proyectados en una
  imagen de TV.
Comparación microscopios electrónicos
DIFERENCIAS

• ÓPTICO              • ELECTRÓNICO

•   PORTAOBJETOS      •   REJILLA DE COBRE
•   VIDRIO DE LUZ     •   HAZ DE ELECTRONES
•   OCULAR            •   LENTES ELECTROMAGNETICOS DEL PROYECTOR
•   OBJETIVOS         •   LENTES ELECTROMAGNETICOS DEL OBJETIVO
•   CONDENSADOR       •   LENTES ELECTOMAGNETICOS DEL
                          CONDENSADOR
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• Definición: Conjunto de técnicas que permite
  el mantenimiento de las células “in vitro”,
  manteniendo al máximo sus propiedades
  fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

• Ventajas de realizar un cultivo celular

• Cultivo en microorganismos, cultivo en
  animales, cultivo en vegetales.
CLASES DE CULTIVOS

PRIMARIOS: Se obtiene directamente de los
 tejidos animales o vegetales.

SECUNDARIOS: Se obtiene de tomar una muestra
 de los primarios y su nuevo cultivo en otra cápsula
 de petri.

DE LINEAS ESTABLECIDAS: son los que derivan de
 tumores
CÉLULAS COMO MODELO
              EXPERIMENTALES
• Drosofila melanogaster



• La rana Xenopus laevis

• El pez cebra
CULTIVO CELULAS VEGETALES

• Las células vegetales tienen
  una      característica  muy
  interesante que es conocida
  como        totipotencia    o
  pluriopotencia. Lo cual ayuda
  que en cultivo se puedan
  generar otros tejidos.

• Células    como    modelo
  experimental:   Arabidopsis
  thaliana
METODO DE LA
    MICROMANIPULACION

• Se basa en la introducción en células y
  tejidos de: microagujas, micropipetas,
  microelectrodos; por medio de aparatos
  especiales que permiten el movimiento
  controlado de estos instrumentos bajo el
  microscopio.
APLICACIONES DEL CULTIVO CELULAR

• Actividad intracelular
• Flujo intracelular
• Ecología celular
• Interacciones celulares
AREAS DE INVESTIGACION:
  virología, investigación del
  cáncer, inmunología,
  ingeniería de proteínas.
VENTAJAS E INCONVENIENTES CON LOS
            CULTIVOS CELULARES
• El     control     del    medio
  fisicoquímico.

• Caracterización y homogeneidad
  de la muestra.

• Técnica sensible

• Los costos de producir células en
  cultivo son diez veces mas que el
  uso de tejido animal.
Técnicas inmunológicas
ELISA

 ELISA Para detectar Antígenos




  Sensibilización                Bloqueo   Incubación con Suero
ELISA

 ELISA Para detectar Antígenos




        Lavado                   Anticuerpo 2º   Revelado
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Cromatografía de intercambio iónico
Electroforesis
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Centrifugación
• Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las
  muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en
  poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor
  que la del medio que las rodea.
• Tipo:
   – centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 g)
   – super-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de
      2000 g a 20000 g)
   – ultracentrífugas (de 15000 g a 600000 g).
• En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara
  para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la
  fricción. En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de
  100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vacío en
  la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y
  muestra.
Centrifugación: coeficientes de sedimentación
• El coeficiente de sedimentación de una partícula o
  macromolécula se calcula dividiendo su velocidad constante de
  sedimentación (en m/s) por la aceleración aplicada (en m/s2).

• El resultado tiene dimensiones de tiempo y se expresa
  habitualmente en svedbergs (S).

• Los valores de coeficientes de sedimentación no son aditivos,
  debido a que dependen tanto de la masa, como de la forma que
  tenga la molécula. Una partícula formada por la unión de dos
  partículas 5 S no tiene un coeficiente de sedimentación de 10 S.

  Por ejemplo, los ribosomas eucarióticos están formados por dos
  subunidades, una 60 S y otra 40 S. Sin embargo, el valor final del
  conjunto del ribosoma no es 100 S, sino 80.
Centrifugación diferencial
Separación por sedimentación en gradiente
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Metodos de estudio celular

  • 1. Métodos de estudio celular Norma Cruz Tapia IIIº Electivo Nº 5
  • 2. Técnicas de estudio de la materia viva
  • 5. LEEUWENHOEK POPULARIZÓ EL USO DEL MICROSCOPIO (1964)
  • 8. Algunos Conceptos… Magnificación Resolución (D) Distancia mínima a la cual Aumento que logra el el equipo puede mostrar equipo dos puntos como entidades separadas
  • 9. CARACTERÍSTICAS • AUMENTO: Producto del numero de aumentos de los lentes (ocular y objetivo) • RESOLUCIÓN: Capacidad para distinguir dos o mas puntos que parecen uno. • PROFUNDIZACIÓN: Capacidad para distinguir un plano de otro. • CAMPO VISUAL: Área circular que se distingue al mirar por el microcopio.
  • 10. PARTES DEL MICROSCOPIO • SISTEMA MECÁNICO: • PIE O BASE: Tres puntos de apoyo para dar estabilidad al microscopio • BRAZO: Transporte del microscopio, sostiene al tubo y la platina. • TUBO: conduce la imagen de la lente del objetivo a la ocular • PLATINA: Lugar donde se deposita el portaobjetos, sujetándolo con dos pinzas. • CARRO: Desplaza la muestra. • TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico: Acerca o aleja el tubo de la platina. Micrométrico: Da claridad a la imagen.
  • 11. • SISTEMA ÓPTICO • OCULAR: Amplia la imagen dada por la lente del objetivo. • OBJETIVOS: Amplia la imagen de la muestra. • CONDENSADOR: Enfoca la luz en la muestra. • DIAFRAGMA. Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
  • 12. MICROSCOPIO ÓPTICO FUNCIONAMIENTO • FUENTE DE LUZ • LENTE CONDENSADORA • MUESTRA • LENTE OBJETIVO • LENTE OCULAR • OJO HUMANO
  • 13. OPTICO CAMPO CLARO • USA LA LUZ VISIBLE • MUESTRA MUY FINA • AUMENTO DE 1000X (100X OBJETIVO, 10X OCULAR) • IMAGEN DENTRO DEL CAMPO MICROSCOPICO • EL SISTEMA MECANICO SOSTIENE EL SISTEMA OPTICO Y LA MUESTRA.
  • 14. ÓPTICO CAMPO OSCURO • CONDENSADOR QUE REFRACTA LA LUZ • LUZ INTESA EN FORMA DE CONO HUECO • CAMPO NEGRO • IMAGEN LUZ BRILLANTE SOBRE EL FONDO • SÓLO BORDES DESTACADOS DE LAS MUESTRAS • DIFICIL ACCESO. • PREPARACION SIN COLOREAR
  • 15. ÓPTICO CONTRASTE DE FASES • REVELA DETALLES IMPERCEPTIBLES CON UN MICROSCOPIO CONVENCIONAL • CONO DE LUZ ESTRECHO • CÉLULAS VIVAS • DETALLAR ESTRUCTURAS INTERNAS • NO ES NECESARIO TEÑIR
  • 17. ÓPTICO DE FLUORESCENCIA • UTILIZA RANGO DE LUZ ULTRAVIOLETA • ABSORVE SELECTIVAMENTE DIFERENTES LONGITUDES DE ONDA DEL RANGO ULTRAVIOLETA • ELEMENTOS ÓPTICOS HECHOS CON CUARZO O SITEMAS DE ESPEJOS ALUMINIZADOS • IMAGEN CON FOSFORESCENCIA • FONDO OSCURO • LAMPARA DE MERCURIO (FUENTE DE LUZ) • AUMENTO DE RESOLUCION CON LONGITUD DE ONDA CORTA
  • 19. MET
  • 21. Microscopio Electrónico de Transmisión: MET La MET no explora superficies: el haz de electrones incidente atraviesa la muestra y genera una sombra de la ultraestructura que es capturada en una pantalla fosforescente , ubicada en la parte inferior de la columna. • Cañón de electrones, que emite los electrones que chocan contra el espécimen, creando una imagen aumentada. • Lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones. • Sistema de vacío es una parte muy importante del microscopio electrónico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe hacer un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características. • Placa fotográfica o pantalla fluorescente que se coloca detrás del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada. • Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser una computadora.
  • 22. MEB
  • 24. Microscopio electrónico de barrido • En el microscopio electrónico de barrido la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV.
  • 26. DIFERENCIAS • ÓPTICO • ELECTRÓNICO • PORTAOBJETOS • REJILLA DE COBRE • VIDRIO DE LUZ • HAZ DE ELECTRONES • OCULAR • LENTES ELECTROMAGNETICOS DEL PROYECTOR • OBJETIVOS • LENTES ELECTROMAGNETICOS DEL OBJETIVO • CONDENSADOR • LENTES ELECTOMAGNETICOS DEL CONDENSADOR
  • 32. • Definición: Conjunto de técnicas que permite el mantenimiento de las células “in vitro”, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. • Ventajas de realizar un cultivo celular • Cultivo en microorganismos, cultivo en animales, cultivo en vegetales.
  • 33. CLASES DE CULTIVOS PRIMARIOS: Se obtiene directamente de los tejidos animales o vegetales. SECUNDARIOS: Se obtiene de tomar una muestra de los primarios y su nuevo cultivo en otra cápsula de petri. DE LINEAS ESTABLECIDAS: son los que derivan de tumores
  • 34. CÉLULAS COMO MODELO EXPERIMENTALES • Drosofila melanogaster • La rana Xenopus laevis • El pez cebra
  • 35. CULTIVO CELULAS VEGETALES • Las células vegetales tienen una característica muy interesante que es conocida como totipotencia o pluriopotencia. Lo cual ayuda que en cultivo se puedan generar otros tejidos. • Células como modelo experimental: Arabidopsis thaliana
  • 36. METODO DE LA MICROMANIPULACION • Se basa en la introducción en células y tejidos de: microagujas, micropipetas, microelectrodos; por medio de aparatos especiales que permiten el movimiento controlado de estos instrumentos bajo el microscopio.
  • 37. APLICACIONES DEL CULTIVO CELULAR • Actividad intracelular • Flujo intracelular • Ecología celular • Interacciones celulares AREAS DE INVESTIGACION: virología, investigación del cáncer, inmunología, ingeniería de proteínas.
  • 38. VENTAJAS E INCONVENIENTES CON LOS CULTIVOS CELULARES • El control del medio fisicoquímico. • Caracterización y homogeneidad de la muestra. • Técnica sensible • Los costos de producir células en cultivo son diez veces mas que el uso de tejido animal.
  • 40. ELISA ELISA Para detectar Antígenos Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero
  • 41. ELISA ELISA Para detectar Antígenos Lavado Anticuerpo 2º Revelado
  • 47. Centrifugación • Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor que la del medio que las rodea. • Tipo: – centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 g) – super-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de 2000 g a 20000 g) – ultracentrífugas (de 15000 g a 600000 g). • En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción. En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vacío en la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra.
  • 48. Centrifugación: coeficientes de sedimentación • El coeficiente de sedimentación de una partícula o macromolécula se calcula dividiendo su velocidad constante de sedimentación (en m/s) por la aceleración aplicada (en m/s2). • El resultado tiene dimensiones de tiempo y se expresa habitualmente en svedbergs (S). • Los valores de coeficientes de sedimentación no son aditivos, debido a que dependen tanto de la masa, como de la forma que tenga la molécula. Una partícula formada por la unión de dos partículas 5 S no tiene un coeficiente de sedimentación de 10 S. Por ejemplo, los ribosomas eucarióticos están formados por dos subunidades, una 60 S y otra 40 S. Sin embargo, el valor final del conjunto del ribosoma no es 100 S, sino 80.
  • 50. Separación por sedimentación en gradiente de sacarosa