La microscopía es la técnica de producir imágenes visibles de estructuras demasiado pequeñas para ser percibidas a simple vista. Los orígenes del microscopio son inciertos, pero probablemente se inventó en Holanda entre 1590 y 1610. A lo largo de los siglos, se han desarrollado diferentes tipos de microscopios como el microscopio óptico de campo claro, el microscopio de contraste de fases y el microscopio electrónico, mejorando la calidad de las imágenes y permitiendo observar detalles cada vez más peque

1. Microscopia
Breve reseña histórica
Los orígenesdel microscopiosoninciertos;probablementeenHolanda,enlaciudadde
Middelburgentre 1590 y 1610, algunaspersonasrelacionadasconel mundodel espectáculo
inventarontantoel microscopiocompuestocomoel telescopio.HansJanssenysuhijoZacharias,
fabricantesde anteojos,se mencionancomoposiblesinventores.Sinembargo,algunosatribuyen
a GalileoGalileisuinvenciónenlaprimeramitaddel sigloXVII,graciasaque él difundióel
microscopioysu uso.El microscopiocompuestooriginal consistíaendoso más lentes colocadas
enun tuborígido .
Los primerosusuariosbienconocidosfueronM.Malpighi,de Italia,A.vanLeeuwenhoek,de
Holanda;Hooke y N.Grew,de Inglaterra.Leeuwenhoekfabricóunmicroscopiosimple yHooke
utilizóunmicroscopiocompuesto.LosinstrumentosempleadosporLeeuwenhoekeransuperiores
a aquellosutilizadosporHooke,enparte debidoaque se desconocíael efectode lasaberraciones
de las lentesycomocorregirlas.El microscopiocompuestode Hooke sumabalosdefectosde los
dos juegosde lentes(objetivoyocular),dificultandolaobservación,de maneraque enlahistoria
de la microscopíafue Leeuwenhoekquienrealizólamayorcantidadde descubrimientosconsu
microscopiosimple.
Sinembargo,el microscopiocompuestoseríael instrumentoconmásfuturo.El instrumentode
Hooke del año1665 tenía las partesbásicas,doslentes(unaque aumentabalaimagende laotra),
una estructuramecánica,mecanismosde enfoque yunfrascoesféricoparaconcentrarla luz.
Mejorasconsiderablesse hanrealizadodesde entonces.
Aunque algunosfabricantescomoCulpeperyCuff crearonmicroscopiosapropiadosymejorados
por modelosconbasesentrípode y laconocida base enherradura;no obstante,el verdadero
microscopioútil aparecióconlainvenciónde laslentesacromáticas,desarrolladasenInglaterra
por ChesterMoore Hall en1729. El desarrollode losinstrumentosde ópticaesinseparable delde
la industriadel vidrioylafabricaciónde laslentes(61).Sinembargo,aúneradifícil fabricarlentes
acromáticaspoderosasy a finalesdel sigloXVIIIJanyHarmanusvan Deyl lolograrone iniciaronla
comercializaciónde objetivosacromáticos.Laslentesconmayoresaperturasnuméricasfueron
realizadasalrededorde 1890. Un fabricante famosode microscopiosde calidadsuperiorerala
firmade Powell yde Lealand,quieneselaboraronobjetivosde altopoder,apocromáticosyde
inmersiónconunaaperturanuméricade 1,50.
Otros creadoresfueronRossySmith.Karl ZeissJenarealizóobjetivosde inmersióndiseñadospor
Ernst Abbe quienfue el fundadorde lateoría ópticade las lentesdel microscopioydesarrollóel
diseñode lasmismasbasadoenun procedimientomatemáticoriguroso(62).A finalesdelsigloXIX
losmicroscopiosde campoclaro fueronmodificadosparaobtenercampooscuroy polarización,
detallesque permitieronincrementarel contraste.

2. A principiosdel sigloXXlafabricaciónde microscopiosse concentróenAlemaniayenlosaños
sucesivosse desarrollóla fluorescencia,contraste de fase,interferencia,holografía,luz
ultravioleta,rayosX,métodosconelectronesyprotones,microscopioscomputarizadosparala
observación,cuantificaciónyanálisistridimensional.Estosinstrumentosabrieronmuchas
posibilidadesenel campode lamicroscopía.
Los fabricantes(Leitz,Zeiss,Olympus,yotros) respondieronamuchasnecesidades,haciendo
microscopiosmásefectivos,de usouniversal,capacesde utilizarel tipode radiación(luzvisibleo
no) que revele de lamejormaneraposible lanaturalezadel espécimenyconviertadetalles
invisiblesde laimagenenunpatrónvisibleque puedaseranalizado.
Figura.-Microscopio de Leeuwenhoek. La lente está instalada entre dos
placas de bronce. Lo que se quiere observar se coloca en la punta de un
tornillo, de manera que se puede regular en forma precisa la distancia
entre el objeto y la lente; el observador tiene que acercar el ojo al
instrumento y mirar a través de la lente.

3. Figura Microscopio utilizado por Hooke

4. Microscopio

5. Microscopia
Microscopia
La microscopía es la técnica de producir imágenes visibles de estructuras o
detalles demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. En la
microscopía se evidencia los grandes aportes que la física ha hecho a la biología.
Microscopio óptico de campo claro: El microscopio óptico convencional es
compuesto porque posee dos sistemas principales de lentes convergentes (ocular
y objetivo), en cambio los microscopios simples o lupas, de menor aumento,
presentan un solo sistema de lentes biconvexas o plano-convexas montadas en
una armadura metálica. La mayoría de los modelos actuales son binoculares,
aunque también los hay monoculares. El microscopio compuesto convencional se
denomina "de campo claro" o "de campo brillante" porque todo el campo se
ilumina con una lente condensador común, a diferencia de variedades que utilizan
luz difractada, de fondo obscuro. Las muestras que utiliza el microscopio
compuesto convencional deben ser traslúcidas y estar teñidas para entregar
contraste.
Microscopio de contraste de fases: Se basa en la propiedad de los rayos
luminosos de modificar su longitud de onda al atravesar un medio de refracción
distinto. Este desfase de las ondas es imperceptible a la vista, pero el microscopio
lo transforma en diferencias visibles de amplitud, y por lo tanto de intensidad.
Tiene un condensador especial (condensador de Zernike) y placas de retardo o
láminas de desfasado. si hay pequeñas diferencias en el índice de refracción en el
objeto, los rayos luminosos se retardan o adelantan respecto al haz original. Las
distintas densidades originan diferencias de fase entre las ondas luminosas
emergentes, que se transforman en diferencias de intensidad luminosa. Permite
observar detalles en células vivas, provenientes de cultivos o de animales vivos, y
observar material fijado que no puede colorearse. Tiene la desventaja de producir
halos y es difícil obtener una alta resolución. Las muestras deben ser muy
delgadas y no deben abarcar todo el campo de observación. La fuente luminosa
debe ser muy intensa.
Microscopio de campo obscuro: Se basa en que substancias con distinto índice
de refracción desvían de distinta manera los rayos luminosos, lo cual proporciona
contraste a material no teñido, permitiendo visualizar muestras vivas. Un
condensador especial bloquea los rayos centrales y deja pasar los periféricos, que
se reflejan en la cara interna del condensador, iluminando con rayos laterales que
se reflejan o refractan sobre el objeto, el que aparece fuertemente iluminado sobre
fondo obscuro. Para evitar que penetren en el objetivo los rayos que emergen del
condensador, utiliza un diafragma en el objetivo o un objetivo de abertura

6. numérica inferior a 1,1. Es útil para observar límites y movimientos de pequeños
objetos transparentes, tales como quilomicrones, bacterias o espermios, y
partículas ultramicroscópicas, pero sin entregar detalles. Requiere una fuente
luminosa puntiforme muy intensa, lo cual no siempre es fácil si el material es un
ser vivo.
Microscopio de fluorescencia: Su fuente luminosa es una lámpara de rayos
ultravioleta (UV), los que son invisibles al ojo humano pero se tornan visibles al
chocar con un objeto fluorescente. Posee dispositivos que permiten transmitir
radiación UV a muestras que la absorben y emiten radiación de longitud más
larga. Un filtro impide que los rayos blancos producidos juntos con los UV
enmascaren la fluorescencia, otro filtro bloquea la luz UV que podría dañar los
ojos del observador y deja pasar la fluorescencia. Sirve para observar estructuras
fluorescentes o teñidas con colorantes fluorescentes (fluorocromos). Entrega
imágenes de gran contraste y especificidad. Se utiliza para moléculas orgánicas,
microorganismos, reacciones antígeno-anticuerpo y diagnóstico de cáncer.
Inyectando a un animal una substancia fluorescente permite estudiar procesos
metabólicos, tales como formación de orina o secreción biliar. Con inyección
directa a nivel celular facilita el estudio de uniones intercelulares y vías nerviosas.
Con el método de epifluorescencia, el objeto, previamente marcado con
fluorocromo, se ilumina desde arriba por reflexión, de manera que la luz excitadora
no atraviesa el espesor del corte y la fluorescencia ocurre en la superficie, dando
una mayor nitidez.
Microscopio electrónico de transmisión: De disposición general similar al
óptico, utiliza electrones para formar la imagen. Como los electrones tienen
longitud de onda entre mil y cien mil veces inferior a la luz visible, posee mayor
poder de resolución que los microscopios ópticos. Debido a las aberraciones de
las lentes electromagnéticas y al contraste de las muestras su límite de resolución
en la práctica no es tan bueno como el teórico, llegando hasta 0,2 nm en redes
cristalinas. Tiene un filamento de tungsteno incandescente, una bomba de vacío
de alto rendimiento, bobinas electromagnéticas que rodean al haz de electrones a
diferentes niveles y un sistema traductor de imágenes con pantalla fluorescente o
placa fotográfica. El filamento de tungsteno calentado emite un haz de electrones
en el vacío, logrado mediante la bomba. Los electrones se aceleran entre el
filamento y un ánodo por diferencia de potencial de alta tensión de 40.000 a
100.000 voltios y se desplazan en línea recta, pero se desvían y concentran por
efecto de los campos electromagnéticos formados por las bobinas. Los modelos
modernos disponen de dos lentes condensadores y cuatro que forman la imagen,
cuya distancia focal se modifica ajustando la corriente que pasa por los
enrollamientos, lo cual permite variar el aumento desde pocos cientos de veces

7. hasta cerca del millón de diámetros. La preparación de los objetos requiere
ultramicrótomos de alta velocidad y técnicas especiales de fijación (generalmente
con glutaraldehido) y de inclusión (con resinas epóxicas). Las secciones,
ultradelgadas (típicamente de 0,1 um de grosor) se tiñen mediante inmersión en
soluciones de un metal pesado (uranio o plomo).
Microscopio electrónico de transmisión: utiliza un haz fijo de electrones y en la
formación de la imagen ocupa los electrones primarios, transmitidos por el
espécimen, por eso los cortes deben ser muy delgados, menores de un
micrómetro, y no puede utilizarse en el estudio de células vivas.
Microscopio electrónico de barrido: La lente condensadora produce un haz fino
de electrones, de sólo 0,0015 micrómetros, que barre sistemáticamente la
superficie de una preparación previamente recubierta por metal pesado. el haz
electrónico excita la emisión de un haz secundario de electrones de menor energía
desde la preparación, el que es recogido por un detector de centelleo, que
convierte los impactos de los electrones en destellos de luz. Cada destello se
amplifica electrónicamente en un tubo fotomultiplicador que barre sincrónicamente
con el haz, formándose con la señal resultante una imagen sobre una pantalla de
rayos catódicos. Tiene alto poder de penetración, su resolución es de entre 1 y 20
nanómetros y su aumento entre 15 y 50.000 diámetros, según el material, voltaje y
distancia de trabajo. Su gran profundidad de foco da a la imagen un impresionante
aspecto tridimensional. No se necesitan cortes ultrafinos, utiliza fragmentos sólidos
de tejido. Permite observar muestras frágiles por deshidratación controlada.
Partes Del Microscopio
* Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se
coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente
de iluminación situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos
sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de
desplazamiento permite mover la preparación de delante hacia atrás o de
izquierda a derecha y viceversa. En la parte posterior de uno de los laterales se
encuentra un nonius que permite fijar las coordenadas de cualquier campo óptico;
de esta forma se puede acudir al cuando interesa.
* Revolver: Es un sistema que coge los objetivos, y que rueda para utilizar un
objetivo u otro.
* Tornillos Macro Y Micrométrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina
hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico lo hace de forma rápida y el
micrométrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la
platina a una determinada altura.

8. * Foco: Se trata de una lámpara halógena de intensidad graduable. Está situada
en el pie del microscopio. Se enciende y se apaga con un interruptor y en su
superficie externa puede tener una especie de anillo para colocar filtros que
facilitan la visualización.
* Condensador Y Diafragma: El condensador es un sistema de lentes situadas
bajo la platina su función es la de concentrar la luz generada por la fuente de
iluminación hacia la preparación. En el interior del condensador existe un
diafragma (iris) cuya función es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de
lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la cantidad de luz y
ajusta la Apertura Numérica).
* Oculares: Están colocados en la parte superior del tubo. Se denominan así,
porque están muy cercanos al ojo. Su función es la de captar y ampliar la imagen
formada en los objetivos. En los modernos microscopios hay dos oculares
(microscopios binoculares) que están unidos mediante un mecanismo que permite
ajustar la distancia interpupilar. En general los más utilizados son los de 10X
(producen un aumento de 10 veces).
* Objetivos: Están colocados en la parte inferior del tubo insertados en una pieza
metálica, denominada revolver, que permite cambiarlos fácilmente. Generan una
imagen real, invertida y aumentada. Los más frecuentes son los de 4, 10, 40, y
100 aumentos. Este último se llama de inmersión ya que para su utilización se
necesita utilizar aceite de cedro sobre la preparación. En la superficie de cada
objetivo se indican sus características principales, aumento, apertura numérica, y
llevan dibujado un anillo coloreado que indica el número de aumentos (rojo 4X,
amarillo 10X, azul 40X y blanco 100X).
Manejoy Uso Del Microscopio
1- Colocar el objetivo de menor aumento
2- Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3- Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el
de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias. Para realizar el enfoque:
4- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada. El
objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación
6- Empleo del objetivo de inmersión:
- Bajar totalmente la platina.

9. a. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que
nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
b. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino
entre éste y el de x40.
c. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
d. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de
inmersión.
e. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la
lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y
se adosara a la lente.
f. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el
objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x
por lo que el riesgo de accidente es muy grande.
Clasificación bacteriana
Fenotípica: Las bacterias pueden clasificarse según su capacidad de retención de
la tinción de gram positivos y negativos. Por su forma peculiar ( cocos, bacilos,
espirilos). Por su aspecto macroscópico ( propiedades hemolíticas en un medio de
agar sangre, la pigmentación, el tamaño y la forma de colonias.
Genotípica: El método más preciso de la clasificación de las bacterias es el
análisis del material genético. Mediante el empleo de sondas moleculares, se
extrae el ADN del microorganismo a identificarse.
Analítica: Se las clasifica en género especie y subespecie. El patrón
cromatográfico de los ácidos micólicos de la pared celular. Análisis de los lípidos
presentes de la célula. Análisis de las proteínas de la célula y de las enzimas.