Las mitocondrias son organelos donde se producen reacciones de oxidación que generan la mayor parte del ATP en la célula. Contienen dos membranas que definen un espacio intermembrana y una matriz. En la matriz ocurren las reacciones del ciclo del ácido cítrico y la fosforilación oxidativa en la membrana interna, la cual usa un gradiente de protones para sintetizar ATP. Las mitocondrias pueden usar piruvato o ácidos grasos como combustible para generar acetil-CoA y almacenar energía

1. CURSO BIOLOGÍA CELULAR MITOCONDRIAS, CLOROPLASTOS, PEROXISOMAS Dr. Alejandro Roth. 2007

2. Mitocondrias Son organelos característicos de las células eucarióticas , y se postula que son resultado de un evento endosimbiótico. En ellas se produce una serie de reacciones de óxido-reducción cuya energía libre es utilizada para la síntesis de ATP. En las células aeróbicas, el piruvato formado en la glicólisis (anaeróbica) es transportado a la mitocondria donde es oxidado por el O 2 a CO 2 . Estas reacciones de oxido-reducción que ocurren en la mitocondria generan el grueso del ATP producido por conversión de glucosa a CO 2 . Gray et al. (1999); Science 283, 1476 Hipótesis alternativas que describen el origen de las células eucariontes. 1. Fusión de un Archaeobacterio metanogénico (huesped que requiere H) con Proteobacterium (simbionte productor de hidrógeno) 2. Eucarionte amitocondrial producido pot la fusión de Archaeobacterio con un Proteobacterium, adqusición de mitocondrias por endosymbiosis con un alpha-Proteobacterium. 1 2

3. El ATP es un compuesto intermediario clave en una serie de procesos bioquímicos celulares en los cuales se hidroliza. ATP ADP + Pi (HPO 4 -2 ) La energía libre de hidrólisis  G h del ATP es de aprox. 12 kcal/mol. De esta energía, las reacciones más eficientes usan aprox. 7 kcal/mol. El resto, aprox. 5 kcal/mol, se libera al medio en forma de calor.

4. Organización morfofuncional Las mitocondrias poseen dos membranas fosfolipídicas que definen el espacio intermembranas y la matriz. . ADN mitocondrial Mitocondrias en movimiento por sobre citoesqueleto de microtúbulos. Células H9c2 expresan tubulinaGFP, con las mitocondrias marcadas con mitoDsRed. Yi et al, 2004. JCB, Volume 167, Number 4, 661-672

5. Organización morfofuncional Membrana externa : contiene proteínas integrales: enzimas (i.e. monoamino oxidasa y canales acuosos débilmente selectivos a aniones (VDACs) y permeables a moléculas con PMs hasta 4 o 5 KDa. Membrana interna : Plegada formando las crestas mitocondriales . Contiene: lípidos 30% ( PC, PE, cardiolipina) y proteínas integrales (70%): complejo multienzimático de la cadena respiratoria, ATPasa F 0 F 1 o ATP sintetasa, transportadores y canales iónicos Matriz mitocondrial : contiene enzimas, que participan en la oxidación de piruvato y ácidos grasos y las del ciclo del ácido cítrico . Además, DNA mitocondrial, ribosomas, tRNA y enzimas para la expresión de los genes mitocondriales . Cardiolipina, difosfatidilglicerol

6. Mitocondrias de crestas tubulares. Glándula suprarrenal http://www.drjastrow.de/EMAtlasE.html Mitocondrias de crestas Laminares Reconstrucción de tomografía de mitocondrias con crestas laminares. Tejido: grasa parda. Perkins et al (1998). J. Bioenergetics and Biomembranes, 30, 431-442.

7. Reacciones químicas en la mitocondria Hay tres grupos de reacciones que ocurren en la membrana interna y la matriz: 1- Oxidación del piruvato o ácidos grasos a CO 2 acoplada a la reducción de los compuestos portadores de electrones NAD + y FAD a NADH y FADH 2 . 2- Transferencia de electrones desde el NADH y FADH 2 al O 2 : ocurren en la membrana interna y están acopladas al transporte de protones y a la generación de una diferencia de potencial electroquímico de H + a través de dicha membrana . 3- Captura de la energía almacenada en el gradiente electroquímico de protones para la síntesis de ATP por el complejo ATPasa F 0 F 1 e - Lodish et al . 2004 H + H + H + H + H + H + e - FADH 2

8. Transporte de sustratos al interior de la mitocondria: piruvato y Acil-CoA-de-AcGrasos

9. Estructuras del NAD y del FAD en sus formas oxidadas y reducidas

10. Activación: de piruvato a Acetil-CoA, Las mitocondrias pueden usar piruvato ( CH 3 -CO-COO - ) o ácidos grasos como combustible, para formar la importante molécula portadora activada: acetil CoA. El piruvato generado durante la glicólisis es transportado a través de las membranas mitocondriales a la matriz. Allí reacciona con la coenzima A para formar acetil CoA , NADH y CO 2 en una reacción catalizada por el complejo piruvato deshidrogenasa . complejo piruvato deshidrogenasa

11. En el citosol los ácidos grasos libres son esterificados a la coenzima A para formar acil-CoA en una reacción exergónica acoplada a la hidrólisis de ATP a AMP y PPi. Las moléculas de acil-CoA se transportan a la mitocondria donde son oxidadas a acetil CoA y moléculas de acil CoA acortadas en dos átomos de carbono (n-2). Al mismo tiempo una molécula de NAD + es reducida a NADH y una de FAD a FADH 2 . Fuente de energía en las mitocondrias: Oxidación mitocondrial de ácidos grasos

12. Ciclo del ácido cítrico El paso final de la oxidación de los carbohidratos y lípidos se produce en el ciclo del ácido cítrico o ciclo de Krebs . Reacciones por enzimas en la matriz mitocondrial. Sustrato fundamental es el acetil CoA. Primero, un residuo acetilo del acetil CoA se condensa con una molécula de oxaloacetato para dar citrato . Luego, a través de una secuencia de reacciones (etapas 2 a 8) cada molécula de citrato es convertida en oxaloacetato perdiendo 2 moléculas de CO 2 en el proceso. En el ciclo, cuatro pares de electrones son removidos de los átomos de carbono: tres pares de e - son transferidos a tres moléculas de NAD + para formar 3NADH + 3H + y un par es transferido al aceptor FAD para formar FADH 2 .

13. Ciclo del ácido cítrico ATP formado =?

14. Fosforilación oxidativa La fosforilación oxidativa es el proceso en cual se forma ATP como resultado de la transferencia de electrones desde el NADH o FADH 2 al O 2 por medio de una serie de transportadores de electrones en la membrana interna mitocondrial . Las reacciones de la vía glicolítica y del ciclo de Krebs producen la conversión de 1 molécula de glucosa en 6 de CO 2 y la reducción de 10 NAD + a 10 NADH y 2 FAD a 2 FADH 2 .

15. Fosforilación oxidativa El NADH y el FADH 2 transfieren electrones a la cadena respiratoria ubicada en la membrana interna mitocondrial (MIM) constituida por tres grandes complejos enzimáticos : el complejo I NADH deshidrogenasa (NADH-CoQ reductasa, 880 kD) , el complejo III citocromo b-c1 (CoQ-citocromo c reductasa) y el complejo IV citocromo c oxidasa . coenzima Q proteína soluble

16. Fosforilación oxidativa Cada uno de estos complejos actúa como una bomba de protones impulsada por el transporte de electrones. La pérdida de electrones regenera las formas oxidadas de NAD + y FAD y las formas reducidas del aceptor. Los electrones son finalmente transferidos al O 2 . Los  G de estas reacciones son muy negativos, indicando éstas son fuertemente exergónicas. Al pasar electrones de una molécula transportadora a la otra la energía liberada es usada para bombear protones al espacio intermembranas, generándose una diferencia de potencial electroquímico de protones (  μH + ) a través de la membrana interna. soluble protein coenzima Q ( Q )

17. Síntesis quimiosmótica de ATP La síntesis de ATP se realiza utilizando la energía almacenada en forma de gradiente electroquímico de protones a través de la membrana interna, vía la ATPasa F 0 F 1 . Este mecanismo, de un acoplamiento quimiosmótico fue propuesto por Peter Mitchell en 1961, hipótesis que no fue aceptada al comienzo pero después fue comprobada experimentalmente. P. Mitchell recibió por ello el premio Nobel en 1978. Los 2 componentes del gradiente electroquímico de protones H + H + H + H + V - 120 mV

18. Síntesis de ATP La ATPasa F 0 F 1 funciona esencialmente como un motor molecular. Están formadas por dos dominios: F 1 y F 0 El complejo F 0 F 1 o ATPasa F 0 F 1 acopla el flujo de protones a favor de su gradiente a la síntesis de ATP. Actúa como una ATP sintetasa. (3 H + s/ATP) F 0 contiene tres tipos de subunidades a, b y c . F 1 está compuesto de 5 polipéptidos diferentes:  ,  ,  ,  y  , H +

19. Transporte de metabolitos en la mitocondria La energía del gradiente electroquímico de protones también se utiliza para el transporte activo a través de la MIM de una serie de metabolitos que participan en las reacciones que ocurren en la matriz mitocondrial, en co-transporte o contra-transporte con H + . El transporte de PO 4 -3 y piruvato hacia la matriz es mediado por transportadores que acoplan la entrada de fosfato y piruvato con el flujo de H + a favor de su gradiente electroquímico. La entrada de ADP a la matriz es mediada por un contratransportador, acoplada a la salida de ATP, en un proceso impulsado por el gradiente de potencial. El potencial de membrana impulsa también la acumulación de Ca 2+ . Ca 2+

20. Comparación de la combustión con las oxidaciones biológicas Si el hidrógeno se quemara la mayor parte de la energía se liberaría como calor. En contraste, en las oxidaciones biológicas la energía liberada es almacenada en una forma útil para la célula por medio de la cadena transportadora de electrones. El resto de la energía de oxidación es liberada como calor.

21. Resumen de la fosforilación oxidativa en mitocondrias http://www.nature.com/nrg/journal/v2/n5/animation/nrg0501_342a_swf_MEDIA1.html

22. Enfermedades Mitocondriales Fallas de mecanismos mitocondriales se han observado en diversas patologías: Cáncer, infertilidad, diabetes, enfermedades cardiovasculares, ceguera, sordera, falla renal, fallas hepáticas, migrañas, etc.. La capacidad de generar radicales libres las relacionan con envejecimiento y enfermedades neurodegenerativas. Las primeras enfermedades mitocondriales fueron descritas en 1988 Cuando son enfermedades genéticas son difíciles de diagnosticar por que: La herencia puede ser materna si la falla está en el genoma mitocondrial, pero entra a jugar el número de mitocondrias mutantes (los individuos presentan diferentes niveles de afección en diferentes lugares del cuerpo). La mutación puede ser autosomal (estár localizada en un gen nuclear que codifica una proteína mitocondrial. La mutación puede surgir espontáneamente en un indviduo

23. Fotosíntesis : H 2 O y CO 2 -> HCOH + O 2 Síntesis de amino ácidos, lípidos y componentes de membrana Reducción de nitrito (NO2-) a amonio (NH3), paso esencial del ciclo del nitrógeno. Uno de varios tipos de plastidios (todos con el mismo genoma) Remanente de Genoma propio (90% traspasado al núcleo, 120 a 160 kb. 120 genes ). 5 a 10 μm de longitud. (mitocondrias: 1 a 2 μm) Cloroplastos: estructura y función

24. La fotosíntesis, es el proceso de conversión de energía luminosa en energía química y tiene lugar en estructuras especializadas en bacterias fotosintéticas, algas y plantas. Los cloroplastos capturan energía luminosa (h ν ) y la utilizan para sintetizar compuestos orgánicos, en una serie de reacciones, a partir de CO 2 atmosférico (fijación del carbono). Al igual que las mitocondrias éstos organelos poseen una membrana externa y una interna con un espacio intermembranas. La membrana interna rodea al estroma, un compartimiento, análogo a la matriz mitocondrial. En el estroma hay estructuras membranosas en forma de sacos planos denominados tilacoides que se apilan formando los grana. Diferentes granas se unen a través de regiones de la membrana tilacoide llamados láminas estromales. Cloroplastos y Fotosíntesis Grana

25. Cloroplastos Los cloroplastos poseen tres diferentes membranas: externa, interna y tilacoide y tres espacios separados: intermembranas , estroma , y lumen del tilacoide. La membrana tilacoide constituye el sitio de la fotosíntesis y es análoga a las crestas mitocondriales . Allí ocurren las reacciones acopladas de oxido-reducción que generan la fuerza protón-motriz (FP-M). La membrana tilacoide contiene varias proteínas integrales (fotosistemas I y II, y el complejo citocromo b 6 -f), compuestos transportadores de e - (plastoquinona compuesto liposoluble), plastocianina (proteína pequeña con un centro Fe-S), pigmentos que absorben luz, (clorofila el más importante) y el complejo F 0 F 1 o ATPasa F 0 F 1 . clorofila luz luz h ν h ν H + H + FS-I FS-II lumen estroma

26. Fotosíntesis En la fotosíntesis se pueden distinguir dos procesos: 1.- La fase luminosa, constituida por reacciones fotosintéticas de transferencia de electrones . Energía derivada de la luz solar energiza electrones en las moléculas de clorofila asociadas a los complejos multiprotéicos llamados fotosistemas I y II , que forman parte de una cadena transportadora de electrones ubicada en la membrana del tilacoide. En el FSII la clorofila a + es muy oxidante y captura los electrones de un dador: el H 2 0 , que se rompe en reacciones catalizadas por un complejo proteico y como subproducto se produce O 2 : 2H 2 O + 4 h ν 4H + + 4e - + O 2 LUMEN 4 h ν h ν reaction center

27. Fotosíntesis Durante el transporte de electrones en la cadena se bombean protones a través de la membrana tilacoide hacia el lumen del tilacoide y el gradiente de potencial electroquímico de H + s generado, se utiliza para sintetizar ATP vía la ATPasa F 0 F 1 . Como etapa final se reduce el NADP + a NADPH . LUMEN 4 h ν h ν reaction center

28. Comparación de la fotosíntesis con la fosforilación oxidativa . En la fotosíntesis, la transferencia de electrones inducida por la luz impulsa el transporte de protones al lumen o espacio tilacoide. Los protones fluyen fuera del lumen impulsados por su gradiente de potencial químico a través de la ATP sintetasa para generar ATP en el estroma. También la energía derivada de la luz solar es utilizada para producir NADPH requerido para la subsiguiente conversión de CO 2 a carbohidratos. En la fosforilación oxidativa el flujo de electrones a lo largo de la cadena respiratoria impulsa el bombeo de protones fuera de la matriz mitocondrial. El gradiente de protones creado impulsa su flujo hacia a través de la ATP sintetasa para generar ATP en la matriz. h ν 4 h ν H + H + H +

29. Orientación de la membrana y sentido del movimiento de protones a través de la F 0 F 1 ATP-sintetasa en bacterias, mitocondrias y cloroplastos h ν

30. Fotosíntesis 2.- La fase de las reacciones de fijación de carbono o reacciones oscuras . En éstas, el ATP y NADPH producidos en las reacciones fotosintéticas de transferencia de electrones son utilizados para impulsar la conversión del CO 2 a hidratos de carbono (fijación del carbono) comenzando en un ciclo de reacciones (ciclo de Calvin). Cada molécula de CO 2 es agregada a una de ribulosa-1,5 difosfato para dar 2 moléculas de 3-fosfoglicerato . Estas reacciones que producen azúcares y otros compuestos orgánicos en las hojas de las plantas, comienzan en el cloroplasto (almidón) y continúan en el citosol (sacarosa) rubisco 2 gliceraldehído 3-fosfato 1 glucosa

32. Peroxisomas Son pequeños organelos que contienen enzimas involucradas en una diversidad de reacciones metabólicas, incluyendo varios aspectos del metabolismo energético. Carecen de DNA y sus proteínas son codificadas por genes nucleares. Se replican por división. Contienen enzimas que oxidan varios sustratos orgánicos, generando peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ). La oxidación de los ácido grasos en peroxisomas produce grupos acetilo ( CH 3 -CO- ), usados en reacciones biosintéticas, pero no ATP . Junto a las mitocondrias, son los principales sitios de utilización de oxígeno. Una hipótesis es que los peroxisomas son un vestigio de un antiguo organelo que llevaba a cabo todo el metabolismo de oxígeno en células eucarióticas ancestrales . Las inclusiones paracristalinas electro-densas están compuestas de la enzima urato oxidasa.

34. Peroxisoma con un núcleo de estructura paracristalina en células de hoja de tabaco Peroxisomas (glioxisomas) en células almacenadoras de grasa en cotiledones de tomate . Microfotografías de dos tipos de peroxisomas encontrados en células vegetales

35. Peroxisomas En los peroxisomas, varios sustratos son degradados en las reacciones oxidativas, incluyendo aminoácidos y ácidos grasos. La oxidación de éstos últimos es particularmente importante ya que constituye la principal fuente de energía metabólica. En las células animales, los ácidos grasos son oxidados en los peroxisomas y mitocondrias, pero en levaduras y plantas su oxidación está restringida a los peroxisomas. Los ácidos grasos con más de 12 átomos de carbono se degradan en una serie de reacciones similares a las que ocurren en mitocondrias. Acil CoA acortado en dos átomos de carbono

36. Peroxisomas Durante la oxidación de los ácidos grasos en los peroxisomas, los electrones transferidos a FAD y NAD + durante las reacciones de oxidación son posteriormente transferidos al O 2 , formando H 2 O 2 . El agua oxigenada es una sustancia tóxica para la célula (genera radicales libres, compuestos con electrones desapareados) que es convertida en agua y oxígeno por una catalasa, enzima presente en grandes cantidades en este organelo. Esta enzima cataliza la descomposición del H 2 O 2 en H 2 O y O 2 . 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 En contraste con las mitocondrias, donde la oxidación de los ácidos grasos está acoplada a la formación de ATP, en los peroxisomas la energía liberada es convertida en calor. catalasa

37. Peroxisomas Además de proporcionar un compartimiento para las reacciones de oxidación, los peroxisomas están, involucrados en la biosíntesis de lípidos. En células animales , el colesterol es sintetizado en estos organelos así como en el RE. En el hígado los peroxisomas participan en la síntesis de ácidos biliares que derivan del colesterol. En plantas los peroxisomas juegan dos papeles importantes : En semillas participan en la conversión de ácidos grasos almacenados a hidratos de carbono, que es crítica para la germinación de la planta. En las hojas metabolizan glicolato (CH 2 OH-COO - ), un producto lateral formado durante en ciclo de Calvin en la fotosíntesis.

38. Enfermedades Peroxisomales Falla en la formación del Peroxisoma Falla en una o más de las proteínas que incorporan proteínas al lúmen o la la membrana peroxisomal Espectro Zellweger : Síndrome Zellweyer: sin peroxisomas Adrenoleucodistrofia infantil Refsum's infantil Condrodisplasia punctata rizomélica : daños a la epífisis de los huesos. Fallas en la ß-oxidación Adrenoleucodistrofia : Aparece entre los 5 y los 7 años. Desmielinización asociada con insuficiencia adrenal. Falla en la proteína de transporte de tipo ABC que lleva a una falla en el procesamiento de los ácidos grasos de cadena muy larga. Adrenomieloneuropatía: Aparece a los 27 años (media), de mecanismos similar a la adrenoleucodistrofia, el daño ocurre ppalmente en la médula espina y lleva a paraplejia. Enfermedad de Refsum's de Adultos: elevadas concentraciones de ácido fitánico, producto metilado de la clorofila. Comienza como ceguera nocturna y avanza a retinosis pigmentaria atípica y posteriores daños al SNC. Dieta libre de Clorofila libera de la enfermedad

39. Fin Fine The End