Este documento resume las funciones y características de las mitocondrias en 3 oraciones. Las mitocondrias son organelos que producen ATP a través de reacciones de óxido-reducción en las cuales se transportan electrones para generar un gradiente de protones y fosforilar ADP. Contienen dos membranas y DNA mitocondrial. Las reacciones en la matriz y membrana interna incluyen la oxidación de piruvato y ácidos grasos para reducir NAD+ y FAD, y la fosforilación oxidativa para sintetizar

1. CURSO BIOLOGÍA CELULAR MITOCONDRIAS Dr. Alejandro Roth. 2008

2. Mitocondrias en 4 puntos Son organelos característicos de las células eucarióticas , y se postula que son resultado de un evento endosimbiótico. En ellas se produce una serie de reacciones de óxido-reducción cuya energía libre es utilizada para la síntesis de ATP . En las células aeróbicas, el piruvato formado en la glicólisis (anaeróbica) es transportado a la mitocondria donde es oxidado por el O 2 a CO 2 . Estas reacciones de oxido-reducción generan una diferencia en la concentraci ón de protones entre el interior y el exterior de la membrana interna de las mitocondrias. El transporte de los protones a favor de su gradiente de concentraci ón (∆G<<0) permite acoplar fosfato a ADP, generando el grueso del ATP producido por la conversión de glucosa a CO 2 .

3. Carácter ísticas probables de los protoeucariontes C élulas Depredadoras: Sin pared celular, por lo tanto, capaces de fagocitar. Gran Tamaño, Citoesqueleto N úcleo protegido (de las presas y de las enzimas digestivas). Carácter ísticas probables de las protomitocondrias ¿Par ásitos intracelulares? Poco probable debido a su eficiente metabolismo. Cadena transportadora de H+ en la membrana. Probablemente asociada ya a la generaci ón de energía, pero desarrollada inicialmente para… Sin n úcleo definido. Gray et al. (1999); Science 283, 1476 Hipótesis alternativas que describen el origen de las células eucariontes. 1. Fusión de un Archaeobacterio metanogénico (huesped que requiere H) con Proteobacterium (simbionte productor de hidrógeno) 2. Eucarionte amitocondrial producido pot la fusión de Archaeobacterio con un Proteobacterium, adqusición de mitocondrias por endosymbiosis con un alpha-Proteobacterium. 1 2

4. Organización morfofuncional Las mitocondrias poseen dos membranas fosfolipídicas que definen el espacio intermembranas y la matriz. . ADN mitocondrial Origen bacteriano: Genoma Mitocondrial: Codifica 2 rARN, 22 tARN y 13 polip éptidos Ribosomas: carácter ísticas mixtas Síntesis protéica se inicia en N-fornil-Metionina (igual q’ bacterias) ¿Dónde están los demás genes?

5. Mitocondrias de crestas tubulares. Glándula suprarrenal http://www.drjastrow.de/EMAtlasE.html Mitocondrias de crestas Laminares Reconstrucción de tomografía de mitocondrias con crestas laminares. Tejido: grasa parda. Perkins et al (1998). J. Bioenergetics and Biomembranes, 30, 431-442.

6. Organización morfofuncional Membrana externa : contiene proteínas integrales: enzimas (i.e. monoamino oxidasa y canales acuosos débilmente selectivos a aniones (VDACs) y permeables a moléculas con PMs hasta 4 o 5 KDa. Canales translocadores de prote ínas (TOM) Membrana interna : Plegada formando las crestas mitocondriales . Contiene: lípidos 30% ( PC, PE, cardiolipina) y proteínas integrales (70%): complejo multienzimático de la cadena respiratoria, ATPasa F 0 F 1 o ATP sintetasa, transportadores y canales iónicos. Canales translocadores de prote ínas (TIM) Matriz mitocondrial : contiene enzimas, que participan en la oxidación de piruvato y ácidos grasos y las del ciclo del ácido cítrico . Además, DNA mitocondrial, ribosomas, tRNA y enzimas para la expresión de los genes mitocondriales . Cardiolipina, difosfatidilglicerol (membrana interna)

7. Las mitocondrias son organelos m óviles y activos Movimiento : Las mitocondrias no son organelos s ésiles. Están asociados al citoesqueleto y responden a estímulos . Divisi ón : ¿qué forma tiene una mitocondria? Estamos acostumbrados a una visi ón estática, sin embargo, las mitocondrias forman retículos mitocondriales o se dividen en múltiples organelos. Im ágenes de Alberts et al. MBC, 2008

8. Mitocondrias en movimiento por sobre citoesqueleto de microtúbulos. Células H9c2 expresan tubulinaGFP, con las mitocondrias marcadas con mitoDsRed. Yi et al, 2004. JCB, Volume 167, Number 4, 661-672

9. EYFP ( enhanced yellow fluorescent protein ) con secuencia de de destinamiento a mitocondrias de la SubU VIII de la Citocromo C. SYTOX Orange (N úcleo) y Falloidina-Alexa Fluor 350. Michael W. Davidson , Florida State University

10. Reacciones químicas en la mitocondria Hay tres grupos de reacciones que ocurren en la membrana interna y la matriz: 1- Oxidación del piruvato o ácidos grasos a CO 2 acoplada a la reducción de los compuestos portadores de electrones NAD + y FAD a NADH y FADH 2 . 2- Transferencia de electrones desde el NADH y FADH 2 al O 2 : ocurren en la membrana interna y están acopladas al transporte de protones y a la generación de una diferencia de potencial electroquímico de H + a través de dicha membrana . 3- Captura de la energía almacenada en el gradiente electroquímico de protones para la síntesis de ATP por el complejo ATPasa F 0 F 1 e - Lodish et al . 2004 H + H + H + H + H + H + e - FADH 2

11. El ATP es un compuesto intermediario clave en una serie de procesos bioquímicos celulares en los cuales se hidroliza. ATP ADP + Pi (HPO 4 -2 ) La energía libre de hidrólisis  G h del ATP es de aprox. 12 kcal/mol. De esta energía, las reacciones más eficientes usan aprox. 7 kcal/mol. El resto, aprox. 5 kcal/mol, se libera al medio en forma de calor.

12. Estructuras del NAD y del FAD en sus formas oxidadas y reducidas

13. Transporte de sustratos al interior de la mitocondria: piruvato y Acil-CoA-de-AcGrasos + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi + 2 NADH + 2 H+ + 2 ATP + 2 H2O 2

14. Activación: de piruvato a Acetil-CoA, Las mitocondrias pueden usar piruvato ( CH 3 -CO-COO - ) o ácidos grasos como combustible, para formar la importante molécula portadora activada: acetil CoA. El piruvato generado durante la glicólisis es transportado a través de las membranas mitocondriales a la matriz. Allí reacciona con la coenzima A para formar acetil CoA , NADH y CO 2 en una reacción catalizada por el complejo piruvato deshidrogenasa . complejo piruvato deshidrogenasa

15. En el citosol los ácidos grasos libres son esterificados a la coenzima A para formar acil-CoA en una reacción exergónica acoplada a la hidrólisis de ATP a AMP y PPi. Las moléculas de acil-CoA se transportan a la mitocondria donde son oxidadas a acetil CoA y moléculas de acil CoA acortadas en dos átomos de carbono (n-2). Al mismo tiempo una molécula de NAD + es reducida a NADH y una de FAD a FADH 2 . Fuente de energía en las mitocondrias: Oxidación mitocondrial de ácidos grasos

16. Ciclo del ácido cítrico El paso final de la oxidación de los carbohidratos y lípidos se produce en el ciclo del ácido cítrico o ciclo de Krebs . Reacciones por enzimas en la matriz mitocondrial. Sustrato fundamental es el acetil CoA. Primero, un residuo acetilo del acetil CoA se condensa con una molécula de oxaloacetato para dar citrato . Luego, a través de una secuencia de reacciones (etapas 2 a 8) cada molécula de citrato es convertida en oxaloacetato perdiendo 2 moléculas de CO 2 en el proceso. En el ciclo, cuatro pares de electrones son removidos de los átomos de carbono: tres pares de e - son transferidos a tres moléculas de NAD + para formar 3NADH + 3H + y un par es transferido al aceptor FAD para formar FADH 2 .

17. Ciclo del ácido cítrico ATP formado =?

18. Fosforilación oxidativa La fosforilación oxidativa es el proceso en cual se forma ATP como resultado de la transferencia de electrones desde el NADH o FADH 2 al O 2 por medio de una serie de transportadores de electrones en la membrana interna mitocondrial . Las reacciones de la vía glicolítica y del ciclo de Krebs producen la conversión de 1 molécula de glucosa en 6 de CO 2 y la reducción de 10 NAD + a 10 NADH y 2 FAD a 2 FADH 2 . http://www.nature.com/nrg/journal/v2/n5/animation/nrg0501_342a_swf_MEDIA1.html

19. Fosforilación oxidativa El NADH y el FADH 2 transfieren electrones a la cadena respiratoria ubicada en la membrana interna mitocondrial (MIM) constituida por tres grandes complejos enzimáticos : el complejo I NADH deshidrogenasa (NADH-CoQ reductasa, 880 kD) , el complejo III citocromo b-c1 (CoQ-citocromo c reductasa) y el complejo IV citocromo c oxidasa . coenzima Q proteína soluble

20. Fosforilación oxidativa Cada uno de estos complejos actúa como una bomba de protones impulsada por el transporte de electrones. La pérdida de electrones regenera las formas oxidadas de NAD + y FAD y las formas reducidas del aceptor. Los electrones son finalmente transferidos al O 2 . Los  G de estas reacciones son muy negativos, indicando éstas son fuertemente exergónicas. Al pasar electrones de una molécula transportadora a la otra la energía liberada es usada para bombear protones al espacio intermembranas, generándose una diferencia de potencial electroquímico de protones (  μ H + ) a través de la membrana interna. soluble protein coenzima Q ( Q )

21. Síntesis quimiosmótica de ATP La síntesis de ATP se realiza utilizando la energía almacenada en forma de gradiente electroquímico de protones a través de la membrana interna, vía la ATPasa F 0 F 1 . Este mecanismo, de un acoplamiento quimiosmótico fue propuesto por Peter Mitchell en 1961, hipótesis que no fue aceptada al comienzo pero después fue comprobada experimentalmente. P. Mitchell recibió por ello el premio Nobel en 1978. Los 2 componentes del gradiente electroquímico de protones H + H + H + H + V - 120 mV

22. Síntesis de ATP La ATPasa F 0 F 1 funciona esencialmente como un motor molecular. Están formadas por dos dominios: F 1 y F 0 El complejo F 0 F 1 o ATPasa F 0 F 1 acopla el flujo de protones a favor de su gradiente a la síntesis de ATP. Actúa como una ATP sintetasa. (3 H + s/ATP) F 0 contiene tres tipos de subunidades a, b y c . F 1 está compuesto de 5 polipéptidos diferentes:  ,  ,  ,  y  , H +

23. ATPasas de membrana tipo F Están presentes en las membranas plasmáticas de las bacterias, en la membrana tilacoide de cloroplastos y en la membrana interna de las mitocondrias. Catalizan la reacción de síntesis de ATP (  G > 0 ) a partir de ADP y Pi. La energía proviene del gradiente de potencial electroquímico de protones (H + ) a través de la membrana generado por la actividad de la cadena transportadora de electrones. Es decir, actúan como ATP sintetasas. Al igual que las ATPasas tipo V están formadas por dos dominios: F 1 y F 0 El complejo integral F 0 contiene tres tipos de subunidades a, b y c: (a 1 b 2 c 10 en bacterias) y contiene el canal a través del que se transportan los protones . El complejo F 1 está compuesto de 5 polipéptidos diferentes : α , β , y γ . H + H + H + H + H+ Lodish et al . 2000 espacio inntermembranas lumen mitocondria ADP + Pi ATP

24. ATPasas de membrana tipo V Están presentes en las membranas de las vacuolas y en organelos como lisosomas, retículo endoplásmico, cisternas del aparato de Golgi y vesículas cubiertas, bombean electrogenicamente H + desde el citosol al lumen del organelo. Están compuestas de dos partes. Una parte hidrofóbica integral en la membrana (V 0 ) formada por varias copias del proteolípido c y una de a y que constituye la vía de transporte de protones. La forman siete tipos de subunidades diferentes con un PM total de entre 400 y 500 kDa Una cabeza (V 1 ) hidrofílica que está orientada hacia el citoplasma y donde se realiza la hidrólisis del ATP. citosol lumen organelo Lodish et al . 2000 H + H + H + H +

25. Bombas iónicas o ATPasas transportadoras de iones En las membranas celulares existen proteínas integrales bombas iónicas o ATPasas transportadoras de iones que conducen activamente iones usando como fuente de energía el  G q de hidrólisis del ATP : S e encuentran en las membranas plasmáticas de células animales, vegetales y bacterias y en membranas de organelos (mitocondrias, cloroplastos, vacuolas, endosomas, etc.). Existen tres tipos de bombas iónicas: ATPasas de membrana tipo P , tipo V y Tipo F , que se diferencian por su estructura molecular así como por el mecanismo de transporte activo. ATPasas de membrana tipo P Están presentes en las membranas plasmáticas de células eucarióticas y en organelos como retículo endoplásmico , aparato de Golgi . Están formadas por una o dos cadenas polipeptídicas y durante el ciclo de transporte forman un intermediario fosforilado. El modelo más aceptado del mecanismo catalítico de estas ATPasas tipo P es el siguiente : C i + + E 1 E 1 C i + + ATP E 1 C i + ATP E 1 C i + Pi + ADP E 1 C i + Pi E 2 C i + Pi E 2 + C e + + Pi E 2 E 1 Mg 2+

26. Esquema del ciclo de transporte de Na + y K + por la bomba de sodio Es la más estudiada de las bombas tipo P. Está presente en las MPs de las células animales y mantiene los gradientes de concentración de Na + y K + entre la célula y el medio extracelular. Transporta 3 iones Na + hacia el espacio extracelular y 2 K + hacia el citosol utilizando una molécula de ATP por cada ciclo de transporte. Lodish et al . 2004 K + release (intracellular )

27. Transporte de metabolitos en la mitocondria La energía del gradiente electroquímico de protones también se utiliza para el transporte activo a través de la MIM de una serie de metabolitos que participan en las reacciones que ocurren en la matriz mitocondrial, en co-transporte o contra-transporte con H + . El transporte de PO 4 -3 y piruvato hacia la matriz es mediado por transportadores que acoplan la entrada de fosfato y piruvato con el flujo de H + a favor de su gradiente electroquímico. La entrada de ADP a la matriz es mediada por un contratransportador, acoplada a la salida de ATP, en un proceso impulsado por el gradiente de potencial. El potencial de membrana impulsa también la acumulación de Ca 2+ . Ca 2+

28. Comparación de la combustión con las oxidaciones biológicas Si el hidrógeno se quemara la mayor parte de la energía se liberaría como calor. En contraste, en las oxidaciones biológicas la energía liberada es almacenada en una forma útil para la célula por medio de la cadena transportadora de electrones. El resto de la energía de oxidación es liberada como calor.

29. Resumen de la fosforilación oxidativa en mitocondrias http://www.nature.com/nrg/journal/v2/n5/animation/nrg0501_342a_swf_MEDIA1.html

30. Enfermedades Mitocondriales Fallas de mecanismos mitocondriales se han observado en diversas patologías: Cáncer, infertilidad, diabetes, enfermedades cardiovasculares, ceguera, sordera, falla renal, fallas hepáticas, migrañas, etc.. La capacidad de generar radicales libres las relacionan con envejecimiento y enfermedades neurodegenerativas. Las primeras enfermedades mitocondriales fueron descritas en 1988 Cuando son enfermedades genéticas son difíciles de diagnosticar por que: La herencia puede ser materna si la falla está en el genoma mitocondrial, pero entra a jugar el número de mitocondrias mutantes (los individuos presentan diferentes niveles de afección en diferentes lugares del cuerpo). La mutación puede ser autosomal (estár localizada en un gen nuclear que codifica una proteína mitocondrial. La mutación puede surgir espontáneamente en un individuo

31. Dudas sobre las Mitocondrias ¿Qué funci ón cumple la presencia de 2 membranas? ¿Cuál de las dos membranas es crucial para la función de las mitocondrias? ¿Cómo se obtiene la energía para sintetizar ATP? ¿qué es una gradiente electroquímica? ¿Por qu é presentan crestas mitocondriales? ¿qué formas tienen? ¿Cómo se hace una tomografía de una mitocondria en base a microscopía electrónica? ¿cuáles son los posibles or ígenes de las mitocondrias? ¿qué evidencia tenemos de esto? ¿Como se define simbiosis? ¿Cuál es la función de la cardiolipina? ¿qué tipo de proteína es la ATP sintasa? ¿En que se diferencia la ATP sintasa de la Na/K ATPasa? ¿Qué enfermedades mitocondriales pueden afectar los tejidos de manera diferencial?

32. + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi + 2 NADH + 2 H+ + 2 ATP + 2 H2O 2